原花青素抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y分泌Aβ1-42

李 琪，張小強(qiáng)*，陶一凡，朱孟雯，崔丹丹，孫騰騰

(東南大學(xué) 1.公共衛(wèi)生學(xué)院； 2.環(huán)境醫(yī)學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 江蘇 南京 210009)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以細(xì)胞外β淀粉樣斑塊沉積、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏繞形成以及神經(jīng)細(xì)胞死亡為病理特征的神經(jīng)退行性疾病[1]。阿爾茨海默病患病人數(shù)的急劇上升給經(jīng)濟(jì)帶來巨大負(fù)擔(dān)，預(yù)防和控制阿爾茨海默病有重要意義。

Wnt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞增殖、分化、凋亡及細(xì)胞極性、腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲都有影響，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在維持神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)元發(fā)育中起著重要作用[2-4]。大量研究顯示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路的失調(diào)在AD多種病因中發(fā)揮作用[5-6]。

原花青素(proanthocyanidins, PC)是一種具有抗炎、抗氧化，能夠減緩衰老的多酚類物質(zhì)，對(duì)神經(jīng)損傷有顯著的保護(hù)作用[1, 7-8]。關(guān)于PC對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病保護(hù)作用的機(jī)制尚未完全闡明。本研究以β淀粉樣肽(amyloid-β peptide，Aβ)Aβ25-35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞，探究PC對(duì)糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)、β-連接蛋白(β-catenin)以及Aβ1-42表達(dá)水平的影響，并觀察應(yīng)用Wnt/β-catenin信號(hào)通路內(nèi)源性阻斷劑Dickkopf-1(Dkk1)后各指標(biāo)的變化情況，旨在為拓展PC應(yīng)用領(lǐng)域，預(yù)防阿爾茨海默病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系：人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系SH-SY5Y(中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心)。

1.1.2 藥品及主要試劑：原花青素(純度>95%)(上海阿拉丁生化科技有限公司)；Aβ25-35(純度>99%)(ApexBio公司)；重組人Dkk1(Peprotech公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)；胎牛血清(ClarkBio公司)；MTT試劑(Sigma-Aldrich公司)；BCA蛋白濃度試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；人淀粉樣肽(Aβ1-42)ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β抗體和二抗m-IgGκ BP-HRP(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理：將SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素與鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。分為空白組、對(duì)照組、Aβ25-35組(1、5、15、20、25 μmol/L)、原花青素組(0.1、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg/mL)、原花青素(1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg/mL)+Aβ25-35(15.0 μmol/L)組、Dkk1(100 ng/mL)組和Dkk1(100.0 ng/mL)+原花青素(7.5 μg/mL)+Aβ25-35(15.0 μmol/L)組。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力：將SH-SY5Y細(xì)胞以1×104個(gè)/mL的濃度接種于96孔板，每孔100 μL。測(cè)定原花青素對(duì)Aβ25-35染毒的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響時(shí)，原花青素干預(yù)組加入含Aβ25-35培養(yǎng)液預(yù)處理2 h，更換含原花青素培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力。用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)492 nm處測(cè)定吸光度(A值)，計(jì)算各組細(xì)胞活力。

1.2.3 Western blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)：將SH-SY5Y細(xì)胞以1×104個(gè)/mL的濃度接種于6孔板中，每孔2 mL。Dkk1提前1 h加入，其他干預(yù)液添加同1.2.2。用添加蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解液提取蛋白，冰浴操作，BCA法定量蛋白濃度。取適量蛋白進(jìn)行凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別以β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗m-IgGκ BP-HRP室溫孵育2 h，再次洗膜，加超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯影，用Image J軟件分析吸光度值。

1.2.4 ELISA檢測(cè)Aβ1-42的表達(dá)：將SH-SY5Y細(xì)胞以濃度為1×104個(gè)/mL接種于12孔板中，每孔1 mL。收集細(xì)胞上清液于滅菌離心管中，4 ℃，3 000 r/min離心15 min，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算Aβ1-42表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 PC對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞活力及Aβ1-42分泌水平的影響

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)劑量的PC對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)明顯影響(圖1A)。與對(duì)照組相比，15、20、25 μmol/L的Aβ25-35使細(xì)胞活力降低(P<0.05)(圖1B)。與15 μmol/L Aβ25-35組相比，PC干預(yù)24 h后細(xì)胞活力升高(P<0.05)(圖1C)。

與對(duì)照組相比，用15 μmol/LAβ25-35誘導(dǎo)細(xì)胞后，Aβ1-42的分泌水平升高(P<0.05)；以不同濃度PC干預(yù)，Aβ1-42的分泌水平降低(P<0.05)。在一定劑量范圍內(nèi)，PC干預(yù)可降低Aβ1-42表達(dá)水平并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=0.990，P<0.05)(圖1D)。

A-C.effects of PC, Aβ25-35 or PC+Aβ25-35 on cell viability; D.secreted Aβ1-42 was measured by ELISA; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Aβ25-35 group圖1 PC和(或)Aβ25-35對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力及Aβ1-42分泌水平的影響Fig 1 Effects of PC and (or) Aβ25-35 on the cell viability or the secreted Aβ1-42 in SH-SY5Y n=3)

2.2 PC對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組相比，15 μmol/L Aβ25-35處理后，細(xì)胞中β-catenin蛋白及p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。用不同濃度PC干預(yù)后，細(xì)胞中β-catenin蛋白及p-GSK-3β(Ser9)蛋白的表達(dá)水平升高(P<0.05)。在一定劑量范圍內(nèi)，PC干預(yù)可提高β-catenin蛋白的表達(dá)水平并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系(r=0.932，P<0.05)(圖2)。

A.Western blot analysis of the β-catenin、GSK-3β or p-GSK-3β(Ser9) protein levels; B,C.effects of PC on β-catenin or p-GSK-3β(Ser9)protein expressions; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Aβ25-35 group圖2 PC干預(yù)對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞β-catenin和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)的影響Fig 2 Effects of PC on β-catenin or p-GSK-3β(Ser9) protein expressions in SH-SY5Y cells induced

2.3 PC通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路降低Aβ1-42的分泌

與對(duì)照組相比，Aβ25-35組和Dkk1組β-catenin蛋白和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，細(xì)胞分泌的Aβ1-42增多(P<0.05)。預(yù)先加入Dkk1后，與Aβ25-35+PC組相比，細(xì)胞中β-catenin蛋白和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)，Aβ1-42分泌增多(P<0.05)(圖3)。

A.Western blot analysis of the β-catenin、GSK-3β or p-GSK-3β(Ser9) protein levels；B,C. effects of PC on β-catenin or p-GSK-3β(Ser9) protein expressions；D.secreted Aβ1-42 was measured by ELISA; *P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with Aβ25-35 +PC group圖3 PC通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路降低Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Aβ1-42的分泌Fig 3 Effects of PC on the regulation of the secreted Aβ1-42 through Wnt/β-catenin signaling pathway in SH-SY5Y cells induced by n=3)

3 討論

Wnt信號(hào)通路在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期間就開始發(fā)揮功能，并影響成人大腦中的突觸可塑性，該途徑在預(yù)防神經(jīng)退行性疾病中有重要意義[2]。激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以降低神經(jīng)炎性反應(yīng)的發(fā)生，減少抑郁行為的出現(xiàn)，阻止小膠質(zhì)細(xì)胞活化等，該作用與GSK-3β抑制以及β-catenin積累有關(guān)[6]。

p-GSK-3β(Ser9)作為GSK-3β蛋白磷酸化的抑制性位點(diǎn)，可抑制GSK-3β表達(dá)[9]。本研究結(jié)果顯示，在一定劑量范圍內(nèi)，應(yīng)用PC可逆轉(zhuǎn)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達(dá)下降，提高其介導(dǎo)的GSK-3β抑制作用。GSK-3β作為Wnt/β-catenin信號(hào)通路的負(fù)調(diào)節(jié)因子，可參與氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等大量分子和細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)[10]。GSK-3β激活通過調(diào)節(jié)APP的裂解參與AD腦中Aβ的形成和積累，GSK-3β更是確定的tau蛋白主要激酶[11]。

同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，PC干預(yù)還可改善Aβ25-35誘導(dǎo)所致細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)水平的降低。因此，β-catenin可以看做是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)的下游效應(yīng)器。在N2a細(xì)胞中，促進(jìn)β-catenin與TCF4結(jié)合可抑制BACE1表達(dá)，降低Aβ濃度[12]。Wnt/β-catenin信號(hào)功能障礙時(shí)，在小鼠或者離體細(xì)胞水平細(xì)胞內(nèi)Aβ1-40和Aβ1-42的含量會(huì)上升[13]。Aβ沉積和tau蛋白過度磷酸化是阿爾茨海默病的重要病理改變。Wnt/β-catenin信號(hào)通路有可能是未來預(yù)防和治療阿爾茨海默病治療中的重要靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，給予PC干預(yù)后，能明顯降低Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞中Aβ1-42分泌。預(yù)先加入Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑Dkk1后，再用原花青素干預(yù)Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞，細(xì)胞中β-catenin、p-GSK-3β(Ser9)的分泌水平較未加入Dkk1組均降低，而Aβ1-42分泌水平上升。說明PC對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用降低，PC可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路發(fā)揮對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

綜上所述，PC可抑制Aβ25-35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞Aβ1-42生成，該作用可能與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為以Wnt/β-catenin信號(hào)通路為靶點(diǎn)開發(fā)阿爾茨海默病新藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為拓展PC應(yīng)用范圍，開發(fā)PC新功效提供新思路。