PARP14在3種抑郁癥模型小鼠海馬區的表達升高及其與神經炎性反應的關系

李 辰，修建波，許 琪

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 生物化學與分子生物學系 醫學分子生物學國家重點實驗室，北京 100005)

抑郁癥(depressive disorder)是一種發病時表現為情緒低落、興趣減退和愉悅感喪失等癥狀的精神疾病[1]。雖然近年來已發現多種抑郁癥的治療手段，但傳統的抗抑郁藥對大多數患者不能起到很好的效果。PARP14是聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly-adenosine diphosphate-ribose polymerase, PARP)18個家族成員之一，它可以將ADP核糖從NAD+分子中裂解出并轉移到目標蛋白上，實現該蛋白的翻譯后單ADP核糖基化修飾。已有臨床研究提示一些原批準用于惡性腫瘤治療的PARP家族抑制劑在抑郁癥治療中的潛力[2]，而PARP家族成員在抑郁癥中的表達量變化尚未見報道。

除了在DNA損傷修復、抑制癌中發揮作用外[3]，PARP14被發現是一類參與炎性反應調控的分子，如調控巨噬細胞炎性反應、促進B細胞生存等[4-5]。而神經炎性反應假說長久以來被認為是導致抑郁癥的主要機制之一，抑郁癥患者外周和中樞神經系統中具有較高水平的促炎細胞因子，例如白介素1β(IL-1β)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)等[6]。小膠質細胞作為中樞神經系統中重要的固有先天免疫細胞，其功能異常與抑郁癥發生密切相關[7]。本研究旨在探究PARP14與抑郁癥的相關性及其在小膠質細胞炎性反應過程中起到的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：用于建模的8周雄性C57BL/6J小鼠購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，飼養于北京協和醫學院基礎學院實驗動物中心。

1.1.2 細胞培養：小鼠永生化小膠質細胞系BV2為本實驗室保存。

1.1.3 主要試劑：脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)(L8880, Solarbio公司)；PARP14抗體及siRNA(sc377150 & sc76057， Santa Cruz公司)；GeA-69(HY-108708, MCE公司)；細胞培養用胎牛血清(04-001-1ACS, BI公司); DMEM、0.25%胰蛋白酶、青霉素鏈霉素(CC15019、CC017、CC004,邁晨公司)；轉染試劑Lipofectamine 2000與Lipofectamine RNA iMAX(11668019 & 13778150, Thermo Fisher Scientific公司)；Trizol(15596018, Invitrogen公司)；cDNA合成試劑盒(04379012001, Roche公司)。

1.2 方法

1.2.1 抑郁癥動物模型的建立：1)慢性束縛模型[chronic restraint(CRS) model]模型建立按照文獻[8]執行，將18只小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組9只。將實驗組小鼠連續21 d隨機時間放入塑料管中(每天4～6 h)進行建模，對照組無處理，建模結束后進行行為學測試及樣本收集；CRS建模同時，將18只小鼠隨機分為6組，每組3只，分別束縛0、1、3、5、7、14 d后取腦組織樣本。2)慢性不同預知壓力模型[chronic unpredictable mild stress(CUMS)model]使用實驗室前期建模存留樣本[9]。3)LPS模型[lipopolysaccharide(LPS) model]建立按照先前文獻[10]執行，將8只小鼠隨機分為實驗組和對照組，每組4只，實驗組小鼠腹腔注射LPS 1 mg/kg，對照組小鼠注射0.9%氯化鈉溶液，24 h后收集小鼠海馬組織。

1.2.2 行為學檢測：強迫游泳測試(forced swim test, FST)和糖水偏愛測試(sucrose preference test, SPT)被用于測試模型小鼠的抑郁樣行為。強迫游泳測試可以反映出小鼠行為上的絕望，測試時將小鼠放入透明的1 000 L燒杯中，用錄像設備記錄小鼠6 min內的行為，計數后4 min小鼠的不動時間；糖水偏愛測試前3 d小鼠進行雙瓶飲水訓練(一瓶正常飲水、一瓶1.5%蔗糖溶液)，測試前24 h禁水，測試時允許動物自由攝取水或蔗糖溶液，2 h后記錄并計算小鼠的蔗糖偏愛度：蔗糖偏愛度(sucrose preferences，%)=蔗糖消耗量/總消耗量×100%。

1.2.3 細胞培養及處理：BV2細胞系以56 ℃預處理1 h、含10%胎牛血清的培養基培養于37 ℃、5% CO2濃度的細胞培養箱中，隔天傳代。BV2細胞轉染質粒或siRNA時接種至六孔板，培養18～24 h后按轉染試劑說明書進行轉染，每組設置3個復孔，過表達組轉染pcDNA3.1-PARP14質粒，過表達對照組轉染pcDNA3.1-EGFP質粒；敲低組轉染PARP14 si RNA，敲低對照組轉染陰性對照si RNA。分別于轉染后6、24 h換液，38～44 h后加入200 nmol/L LPS，LPS處理6 h后收集細胞進行后續實驗。抑制劑組于細胞接種后40 h加入250 nmol/L PARP14抑制劑GeA-69，無抑制劑對照組加入DMSO，處理2 h后再加入200 nmol/L LPS，LPS處理6 h后收集細胞。

1.2.4 RNA提取與基因表達量檢測：取新鮮海馬組織液氮速凍后保存于-80 ℃直至使用。RNA提取使用Trizol勻漿和氯仿層分離法分離RNA。用轉錄本cDNA合成試劑盒將1 μg RNA反轉錄為cDNA進行后續RT-qPCR檢測。檢測引物見表1，結果以2-ΔΔCt進行相對定量計算。

表1 RT-qPCR檢測引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.3 統計學分析

使用GraphPad Prism6.0和SPSS軟件對實驗數據進行統計分析，兩組數據使用Student’st檢驗進行組間差異分析；多組數據使用單因素方差分析，組間值使用q分析；使用Person相關性檢驗進行相關性分析。

2 結果

2.1 抑郁癥模型小鼠海馬區PARP14表達水平升高

強迫游泳實驗和蔗糖偏愛實驗證實CRS模型組相比對照組表現出明顯的絕望及快感缺失等抑郁樣表型(P<0.01)(圖1A,B)。CRS模型小鼠海馬區中的PARP14蛋白及mRNA表達水平皆顯著高于對照組(P<0.05)(圖1C～E)。同時，PARP14蛋白和mRNA表達水平在束縛第14天時顯著升高(P<0.05)(圖1F,G)。此外，在CUMS模型海馬區也觀察到PARP14蛋白表達水平相較于對照組顯著升高(P<0.05)(圖1H,I)。

Male C57BL/6 mice were exposed to chronic restraint (CRS) model or chronic unpredictable mild stress (CUMS) model induction; A,B.CRS- treated mice and control(Ctrl) mice behaviors: A.forced swim tests, B.sucrose preference tests(n=9); C,D.PARP14 levels in hippocampus of CRS/Ctrl mouse brains, n=3 experimental replicates/group; E.PARP14 mRNA levels in hippocampus of CRS/Ctrl mouse brains(n=5); F,G.PARP14 protein and mRNA levels in mice hippocampus at different restraint time points (0D: CRS 0 day, 1D: CRS 1 day, 3D: CRS 3 day, 5D: CRS 5 day, 7D: CRS 7day dand 14D: CRS 14 day)， #P<0.05 compared with CRS 0 day group; H,I.PARP14 levels in hippocampus of CUMS/Ctrl mouse brains(n=3); *P<0.05, **P<0.01 compared with Ctrl group圖1 CRS和CUMS模型海馬區PARP14的表達水平升高Fig 1 PARP14 levels were increased in the hippocampus of CRS and CUMS

2.2 PARP14與神經炎性反應相關

在CRS模型小鼠海馬組織中，炎性因子IL-1β mRNA表達水平顯著高于對照組(P<0.05)(圖2A)，且PARP14與IL-1β mRNA表達水平正相關(r=0.868,P<0.05)。LPS模型小鼠海馬中，PARP14 mRNA和蛋白表達也顯著上調(P<0.05)(圖2B,C)。BV2細胞中，PARP14 mRNA表達水平在LPS刺激3、6和12 h后均有顯著升高(P<0.01)(圖3A)；同時，PARP14蛋白表達水平在LPS處理6 h后顯著升高(P<0.05)(圖3B,C)。

A.IL-1β mRNA levels in the hippocampus of CRS/Ctrl mouse brains; B.PARP14 mRNA levels in the hippocampus of mice treated with LPS or saline; C.PARP14 protein levels in hippocampus of LPS/control mouse brains； *P<0.05 compared with Ctrl group; #P<0.05, ##P<0.01 compared with saline group圖2 PARP14表達水平與神經炎性反應相關Fig 2 PARP14 expression was related to neuroinflammatory n=4)

A.PARP14 mRNA expression in BV2 cells with LPS treated in different times(0, 3, 6, 12 hours); B,C.PARP14 expression in PBS and LPS group(PSB: BV2 cells treated with PBS in 6 hours, LPS: BV2 cells treated with LPS in 6 hours; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with PBS group圖3 BV2細胞LPS刺激后PARP14表達水平升高Fig 3 PARP14 levels were up-regulated in LPS treated BV2 n=3)

2.3 BV2細胞中過表達PARP14增強LPS誘導的炎性反應

BV2細胞中，過表達組PARP14 mRNA水平顯著升高(P<0.001)(圖4A)。經6 h LPS處理，PARP14過表達組產生的促炎細胞因子TNF-α mRNA顯著升高(P<0.01)(圖4B)，同時抑炎細胞因子白介素10(IL-10) mRNA表達有下降的趨勢，但無統計學意義(圖4C)。

2.4 BV2細胞中敲低Parp14和抑制劑處理降低LPS誘導的炎性反應

在BV2細胞中，敲低組PARP14 mRNA表達水平與對照組相比顯著降低(P<0.05)(圖4D)。與過表達組相反，敲低組LPS處理后促炎細胞因子IL-1β mRNA表達水平顯著低于對照組(P<0.05)， 且IL-10mRNA水平有升高趨勢，但無統計學意義(圖4E,F)。LPS刺激BV2細胞后，PARP14抑制劑GeA-69處理相較于無抑制劑對照組，其促炎因子IL1-β mRNA表達水平顯著降低(P<0.01)(圖4G)，同時TNF-α mRNA表達水平也表現出下降趨勢,但無統計學意義(圖4H,I)。

A.PARP14 mRNA expression in EGFP+LPS/PARP14+LPS group(EGFP+LPS: BV2 cells over-expression EGFP and then treated with LPS, PARP14+LPS: BV2 cells over-expression PARP14 and then treated with LPS); B.TNF-α mRNA expression in EGFP+LPS/PARP14+LPS group; C.IL-10 mRNA expression in EGFP+LPS/PARP14+LPS group; D.PARP14 mRNA expression in si-NC+LPS/si-PARP14+LPS group(si-NC+LPS: BV2 cells transfected with si-NC and then treated with LPS, si-PARP14+LPS: BV2 cells transfected with si-PARP14 and then treated with LPS); E.IL-1β mRNA expression in si-NC+LPS/si-PARP14+LPS group; F.IL-10 mRNA expression in si-NC+LPS/si-PARP14+LPS group; G.IL-1β mRNA expression in DMSO+LPS/GeA+LPS group(DMSO+LPS: BV2 cells pre-treated with DMSO before treated with LPS, GeA+LPS; BV2 cells pre-treated with 250 nmol/L GeA-69 before treated with LPS); H.TNF-α mRNA expression in DMSO+LPS/GeA+LPS group; I.IL-10 mRNA expression in DMSO+LPS/GeA+LPS group; *P<0.01, **P<0.001 compared with EGFP+LPS group; #P<0.05 compared with si-NC+LPS group; ▲P<0.01 compared with DMSO+LPS group圖4 BV2細胞中過表達PARP14增強LPS誘導的炎性因子表達Fig 4 PARP14 levels were up-regulated in hippocampus of LPS induced depression models and LPS treated

3 討論

海馬作為邊緣系統的重要組成部分，與許多情緒相關的腦區(如前額葉皮層和杏仁核)形成神經纖維連接，是當前抑郁障礙相關研究較多的一個腦區[11]。本實驗通過對CRS和CUMS兩種慢性應激小鼠模型海馬中PARP14的mRNA和蛋白表達水平進行分析，發現慢性應激會引起PARP14表達升高，證實了海馬區PARP14表達水平與抑郁癥的相關性。同時，本研究發現CRS模型海馬區存在IL-1β mRNA表達水平的升高，這與神經炎性假說中慢性應激引發神經炎性反應的觀點相符[6]。重要的是，本研究也發現了PARP14 mRNA表達水平與IL-1β mRNA表達水平呈正相關，提示PARP14可能會通過影響神經炎性反應從而對抑郁癥產生影響。本研究在LPS模型中的發現也進一步驗證了PARP14與神經炎性相關的假設。

由于小膠質細胞是中樞神經系統中最重要的炎性反應細胞類型，在慢性應激情況下，與抑郁癥相關的大腦區域小膠質細胞從靜止狀態變為活動狀態，這也被認為是造成壓力期間中樞神經系統炎性反應的重要原因[12]。當使用LPS刺激小膠質細胞時，也觀察到了PARP14蛋白及其mRNA表達水平的升高，這提示PARP14可能在小膠質細胞中發揮作用從而影響神經炎性反應。當改變小膠質細胞PARP14表達后觀察到了其響應LPS刺激后炎性反應的變化， PARP14在小膠質細胞中的過表達可以以通過增加促炎基因的表達，從而增強小膠質細胞的炎性反應；而Parp14在小膠質細胞中的敲低或抑制可以通過抑制促炎基因的表達從而抑制小膠質細胞的炎性反應。

綜上所述，本研究首次發現PARP家族的macro亞家族成員PARP14與抑郁癥的相關性，并提示其可能通過調控小膠質細胞活化而對抑郁樣行為產生影響，但其影響小膠質細胞炎性反應的機制仍然有待研究。雖然之前已發現一些以抑制PARP1為主的PARP家族抑制劑在一些案例中起到了緩解抑郁癥癥狀的作用[2]。但不同于PARP1介導的多聚ADP核糖基化修飾的廣泛作用[13]，PARP14介導的單ADP核糖基化修飾作用可能更為特異，因此其特異性抑制劑潛在的副作用可能也會更小。本研究表明PARP14很有可能成為抑郁癥治療有希望的靶標。