黏蟲UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶UGT33J12基因序列分析及對(duì)兩種殺蟲劑的響應(yīng)

樊 東 ，王繼偉，司修洋，郭 奇，周禮厚

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glycosyltransfer?ases，UGTs）是一類廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌以及病毒內(nèi)多功能超家族酶[1]。UGT糖基化作用參與多種生理代謝過(guò)程[2]，如哺乳動(dòng)物膽汁酸和甾類物質(zhì)生理代謝[3-4]，以及昆蟲角質(zhì)層、色素和嗅覺形成[5]。此外，昆蟲還可利用其降解食物中有毒物質(zhì)[6]，甚至通過(guò)調(diào)節(jié)UGT基因表達(dá)水平改變殺蟲劑抗性[7]。近年研究發(fā)現(xiàn)，UGT對(duì)殺蟲劑解毒代謝具有十分重要作用[8-9]。例如，利用溴氰菊酯和吡唑硫磷分別處理棉鈴蟲Helicoverpa armigera和家蠅Musca domestica后，可顯著提高蟲體內(nèi)UGT 活性，增強(qiáng)殺蟲劑抵抗性[10-11]。該基因家族具有眾多成員[12]，昆蟲體內(nèi)可同時(shí)表達(dá)多個(gè)UGT 基因。過(guò)表達(dá)UGT2B17 基因可顯著增強(qiáng)小菜蛾（Plutella xylo?stella）對(duì)氯蟲苯甲酰胺抗性[13]；棉蚜（Aphis gossy?pii）UGT348A2、UGT344B4 以及UGT344J2 基因過(guò)表達(dá)可提高棉蚜對(duì)噻蟲嗪抗性[14]。研究表明，UGT基因在抗性品系中表現(xiàn)趨同進(jìn)化模式，該基因可能與擬除蟲菊酯[15]、氨基甲酸酯[16]和新煙堿類[17]等抗性相關(guān)。

高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺是兩種常用殺蟲劑，對(duì)田間黏蟲幼蟲具有較好防治效果。高效氯氟氰菊酯，是一種高效、速效Ⅱ型擬除蟲菊酯類殺蟲劑，以觸殺作用為主，可有效防治多種農(nóng)業(yè)害蟲。作用機(jī)理為通過(guò)直接或間接刺激昆蟲神經(jīng)細(xì)胞，引發(fā)昆蟲麻痹及神經(jīng)性抽搐，致昆蟲死亡[18]。氯蟲苯甲酰胺是一類高效二酰胺類殺蟲劑，對(duì)昆蟲天敵相對(duì)安全[19]。作用機(jī)理是苯甲酰胺結(jié)合昆蟲體內(nèi)魚尼丁受體（Ryanodine receptor，RyR），導(dǎo)致鈣離子濃度升高，細(xì)胞內(nèi)滲透壓失衡，抑制昆蟲取食，引起昆蟲肌肉收縮，造成昆蟲癱瘓、死亡[20]。伴隨兩種殺蟲劑使用頻率增加，害蟲對(duì)于兩種殺蟲劑敏感性也隨之降低。

黏蟲（Mythimna seperata），是糧食作物重要害蟲之一[21]，除在我國(guó)新疆和西藏情況不明外，在其他省市地區(qū)均有分布[22]。該蟲屬于鱗翅目（Lepidop?tera），夜蛾科（Noctuidae），具有暴食性、雜食性、遷飛性等特點(diǎn)，對(duì)于禾本科作物危害十分嚴(yán)重[23]。目前，主要以殺蟲劑等化學(xué)手段防治黏蟲，但針對(duì)黏蟲抗藥性研究較少。研究表明，UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶可能參與昆蟲對(duì)殺蟲劑解毒代謝過(guò)程，該過(guò)程和昆蟲抗藥性有關(guān)[24]。但UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺兩種殺蟲劑響應(yīng)卻鮮有報(bào)道。本文基于黏蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，獲得黏蟲一條新的UGT33J12基因，測(cè)定其在黏蟲體內(nèi)經(jīng)高效氯氟氰菊酯與氯蟲苯甲酰胺不同時(shí)間和濃度誘導(dǎo)下表達(dá)特征，為進(jìn)一步研究黏蟲抗性機(jī)理和黏蟲防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源、藥劑

本試驗(yàn)所用黏蟲采自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)向陽(yáng)試驗(yàn)示范基地玉米試驗(yàn)田，采集后放入人工氣候箱內(nèi)，用新鮮玉米葉飼養(yǎng)，氣候箱溫度設(shè)置為（25±2）℃，相對(duì)濕度設(shè)置為70%，光周期為14L:10D。待養(yǎng)至成蟲后，5%蜂蜜水飼喂，并在養(yǎng)蟲籠中懸掛透明褶皺塑料繩，用以成蟲產(chǎn)卵，待卵孵化出幼蟲后，繼續(xù)放入人工氣候箱中，飼養(yǎng)至不同發(fā)育階段備用。試驗(yàn)所用5%高效氯氟氰菊酯乳油購(gòu)自德強(qiáng)生物股份有限公司；20%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑購(gòu)自美國(guó)杜邦公司。

1.2 UGT33J12基因獲得與分析

在黏蟲不同發(fā)育階段，分別選取黏蟲卵、一至六齡幼蟲、蛹期和成蟲，送至安諾優(yōu)達(dá)基因科技公司作轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，基于數(shù)據(jù)分析及序列比對(duì)得到黏蟲UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，使用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物MsUDP-F和MsUDP-R（見表 1）。

通過(guò)PCR 擴(kuò)增并測(cè)序后將結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得序列比對(duì)，驗(yàn)證基因正確性。將驗(yàn)證的UGT基因cDNA序列提交至UGT國(guó)際命名委員會(huì)命名并登錄GenBank。

利用NCBI 預(yù)測(cè)基因開放閱讀框（Open reading frame，ORF）并翻譯成氨基酸序列；利用ProtParam工具（https://web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸序列等電點(diǎn)和分子質(zhì)量[25]；利用SignalP 4.1 Server在線軟件預(yù)測(cè)UGT信號(hào)肽[26]；功能域分析參照王政全等UGT基因序列及進(jìn)化分析方法[27]；根據(jù)獲得的黏蟲UGT33J12 氨基酸序列，在NCBI 網(wǎng)站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上比對(duì)并搜索下載昆蟲UGT氨基酸序列，應(yīng)用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[28]。

表1 引物序列及用途Table 1 Primer sequence and its application

1.3 黏蟲UGT33J12對(duì)殺蟲劑誘導(dǎo)的響應(yīng)

1.3.1 殺蟲劑處理黏蟲

選用發(fā)育正常四齡第1天黏蟲幼蟲，將高效氯氟氰菊酯稀釋成5 個(gè)不同濃度梯度，分別為1.04、2.08、4.17、8.33、16.67 μg·mL-1，以超純水為對(duì)照。在黏蟲幼蟲第2～3腹節(jié)間點(diǎn)滴0.5 μL高效氯氟氰菊酯，點(diǎn)滴30頭，設(shè)3次重復(fù)。處理后置于人工氣候箱中正常飼養(yǎng)，24 h后觀察死亡數(shù)量，根據(jù)供試蟲數(shù)和死亡數(shù)，利用SPSS 21.0軟件計(jì)算確定高效氯氟氰菊酯對(duì)黏蟲LD10、LD30和LD50值。將高效氯氟氰菊酯稀釋為3個(gè)不同劑量（LD10、LD30和LD50）。點(diǎn)滴0.5 μL LD10、LD30和LD50高效氯氟氰菊酯于四齡第1天黏蟲幼蟲第2～3腹節(jié)間，每組試驗(yàn)選取50頭黏蟲幼蟲試驗(yàn)，3 次重復(fù)，取樣時(shí)間為處理3、6、12、24和48 h后，每個(gè)重復(fù)收集5頭存活幼蟲，迅速放到液氮中處理，后保存于-80 ℃冰箱備用。

選用發(fā)育正常四齡第1天黏蟲幼蟲，將氯蟲苯甲酰胺稀釋成5 個(gè)不同濃度梯度，分別為0.3125、0.625、1.25、2.5、5 μg·mL-1，以超純水為對(duì)照。將玉米葉片剪成1 cm2等面積碎片，碎片浸泡在氯蟲苯甲酰胺藥劑中2～3 s，風(fēng)干后飼喂幼蟲，試驗(yàn)組和對(duì)照組各飼喂30頭，設(shè)3次重復(fù)。在人工氣候箱中正常飼養(yǎng)24 h后調(diào)查黏蟲死亡數(shù)，根據(jù)供試蟲數(shù)和死亡數(shù)，利用SPSS 21.0 軟件計(jì)算確定氯蟲苯甲酰胺對(duì)黏蟲LD10、LD30和LD50值。將氯蟲苯甲酰胺稀釋為3 個(gè)不同劑量（LD10、LD30和 LD50）。飼喂四齡第1 天黏蟲幼蟲LD10、LD30和LD50不同劑量氯蟲苯甲酰胺，每個(gè)劑量處理和對(duì)照均飼喂50 頭，設(shè)置3次重復(fù)，取樣時(shí)期及方法同上。

1.3.2 黏蟲總RNA提取和cDNA反轉(zhuǎn)錄

利用RNA 提取試劑盒TRIzol（購(gòu)自Invitrogen）提取不同處理黏蟲總RNA。試驗(yàn)所需研磨管、移液槍頭等耗材需經(jīng)0.1% DEPC 水浸泡24 h 并高溫高壓滅菌，防止提取過(guò)程中RNA 發(fā)生降解。試驗(yàn)過(guò)程均為無(wú)菌環(huán)境，需佩戴口罩、手套。提取RNA使用紫外分光光度計(jì)確定濃度。使用TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照使用說(shuō)明，取2 μL RNA，在65 ℃金屬浴中加熱5 min后取出立即冷卻，冷卻后根據(jù)cDNA 反轉(zhuǎn)錄總體系，補(bǔ)充10 μL ddH2O，再加入 4 μL 混有g(shù)DNA Remover 的4×DN Master Mix，瞬離后轉(zhuǎn)移至PCR 儀中37 ℃處理5 min，再加入4 μL 5×RT Master MixⅡ，37 ℃處理1 h，98 ℃處理5 min。反轉(zhuǎn)錄后cDNA于-20 ℃冰箱保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 黏蟲UGT33J12基因表達(dá)分析

設(shè)計(jì)熒光定量引物UGT33J12- q- F和UGT33J12-q-R（見表 1），以黏蟲β-actin和MsGAP?DH作為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)內(nèi)參基因引物β-actin-F、β-actin-R和MsGAPDH-F、MsGAPDH-R（見表1），應(yīng)用TOYOBO 公司熒光定量染料THUNDERBIRD SYBR qPCRMix和Bio-Rad公司熒光定量PCR儀作qRT-PCR 分析。采用雙內(nèi)參計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[29]，即取兩個(gè)內(nèi)參基因CT值幾何平均值結(jié)合2-ΔΔCT法[30]，應(yīng)用SPSS 21.0軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黏蟲UGT33J12基因序列分析

通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定得到一條新黏蟲UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因，經(jīng)UGT 國(guó)際命名委員會(huì)命名為UGT33J12，基因序列已提交至Gen?Bank，登錄號(hào)為MT873954。UGT33J12 基因全長(zhǎng)1 798 bp，含有一個(gè)開放閱讀框，長(zhǎng)度為1 557 bp，編碼518個(gè)氨基酸（見圖1）。UGT33J12基因編碼氨基酸N 端區(qū)域包含一個(gè)長(zhǎng)度為20 個(gè)氨基酸信號(hào)肽序列，以及起催化作用的組氨酸（H）和天冬氨酸（D）；C 端區(qū)域包含兩個(gè)供體結(jié)合區(qū)（Donor binding regions，DBRs）和一個(gè)保守特征性基序；在供體結(jié)合區(qū)中，鑒定得到8個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基，包括與核苷酸相互作用絲氨酸（S）、色氨酸（W）、谷氨酰胺（Q）和谷氨酸（E），與含磷化合物相互作用蘇氨酸（T）和谷氨酰胺（Q）以及糖苷相互作用天冬氨酸（D）和谷氨酰胺（Q）。利用在線軟件ProtParam 預(yù)測(cè)UGT33J12 基因編碼氨基酸理化性質(zhì)，其分子質(zhì)量為58.95 ku，等電點(diǎn)為8.62。

圖1 黏蟲UGT33J12基因核苷酸序列及蛋白序列比對(duì)分析Fig.1 Nucleotide sequence and amino acid sequence of UGT33J12 in M.separata

2.2 黏蟲UGT33J12 基因氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中選取其他夜蛾科昆蟲UGT氨基酸序列，與黏蟲UGT33J12氨基酸序列作多重序列比對(duì)（見圖2）。參與比對(duì)的氨基酸序列長(zhǎng)度較接近，均位于514～520 aa。黏蟲M.separata（MT873954）與斜紋夜蛾Spodoptera litura（XP_022837581.1）UGT相似性最高，達(dá)78.19%；與草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda（QGA73338.1）相似性為77.15%、海灰翅夜蛾Spodoptera littoralis（AHY99682.1）相 似 性為77.78%、甜菜夜蛾Spodoptera exigua（ANI21993.1）相似性為77.41%、棉鈴蟲H.armigera（AEW43118.1）相似性為 75.14% 、 煙芽夜蛾Heliothis virescens（PCG63789.1）相似性為73.22%、粉紋夜蛾Tricho?plusia ni（XP_026736016.1）相似性為62.12%。

在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)Blastp 比對(duì)搜索，選取斜紋夜蛾S. litura（XP_022837581.1）、草地貪夜蛾S. frugiperda（QGA73338.1）、海灰翅夜蛾S. littoralis（AHY99682.1）、甜菜夜蛾S.exigua（ANI21993.1）、棉鈴蟲H.armigera（AEW43118.1）、煙芽夜蛾H.virescens（PCG63789.1）、粉紋夜蛾T.ni（XP_0267360 16.1）、玉帶鳳蝶Papilio polytes（XP_013139422.1）、柑橘鳳蝶Papilio xuthus（XP_013168850.1）、煙草天蛾Man?duca sexta（XP_037300055.1）、亞洲玉米螟Ostrinia furnacalis（QNS26323.1）、二化螟Chilo suppressalis（QBK47157.1）氨基酸序列，與黏蟲M. separata（MT873954）氨基酸序列通過(guò)MEGA 7.0 軟件ML 法構(gòu)建進(jìn)化樹（見圖3）。

圖2 黏蟲UGT33J12與其他夜蛾科昆蟲UGT氨基酸多重序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of UGT33J12 in M.separata and other UGT amino acids in Noctuidae insects

圖3 黏蟲與其他昆蟲UGT蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of UGT protein in M.separata and other insects

由圖3可知，黏蟲M.separata（MT873954）與斜紋夜蛾S. litura（XP_022837581.1）、草地貪夜蛾S.frugiperda（QGA73338.1）、海灰翅夜蛾S. littoralis（AHY99682.1）、甜菜夜蛾S. exigua（ANI21993.1）、棉鈴蟲H.armigera（AEW43118.1）、煙芽夜蛾H.vi?rescens（PCG63789.1）聚在同一分支上，親緣關(guān)系較近；與粉紋夜蛾T.ni（XP_026736016.1）親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)；與玉帶鳳蝶P.polytes（XP_013139422.1）、煙草天蛾M. sexta（XP_037300055.1）等昆蟲親緣關(guān)系更遠(yuǎn)。

2.3 殺蟲劑對(duì)黏蟲UGT33J12基因表達(dá)量的影響

2.3.1 高效氯氟氰菊酯對(duì)UGT33J12 基因表達(dá)量的影響

采用不同劑量高效氯氟氰菊酯對(duì)黏蟲幼蟲經(jīng)不同時(shí)間處理后，UGT33J12 基因轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異。相同劑量不同時(shí)間處理?xiàng)l件下，LD10處理3、6 和12 h，基因表達(dá)量無(wú)顯著差異，處理24 和48 h，基因表達(dá)量顯著升高；LD30處理3和48 h，基因表達(dá)量無(wú)顯著差異，但處理12和24 h，基因表達(dá)量顯著升高；LD50處理12和24 h，基因表達(dá)量顯著升高。相同時(shí)間不同劑量處理?xiàng)l件下，處理3 h，基因表達(dá)量均下調(diào)，但不同劑量之間無(wú)明顯差異；處理6 h，LD30劑量誘導(dǎo)下，基因表達(dá)量顯著下調(diào)；處理12 h，LD30和LD50劑量誘導(dǎo)下，基因表達(dá)量顯著升高；處理24 h，基因表達(dá)量均顯著升高；處理48 h，LD10劑量誘導(dǎo)下，基因表達(dá)量顯著升高（見圖4）。

2.3.2 氯蟲苯甲酰胺對(duì)UGT33J12 基因表達(dá)量的影響

采用不同劑量氯蟲苯甲酰胺對(duì)黏蟲幼蟲處理不同時(shí)間后，UGT33J12 基因表達(dá)量存在顯著差異。相同劑量不同時(shí)間處理?xiàng)l件下，LD10處理3、6和12 h，基因表達(dá)量顯著下調(diào)，處理24 和48 h，基因表達(dá)量顯著升高；LD30處理6 h，基因表達(dá)量顯著下調(diào)表達(dá)，但處理3、12、24和48 h，基因表達(dá)量顯著升高；LD50處理6 h，基因表達(dá)量顯著下調(diào)表達(dá)，但處理3、24和48 h，基因表達(dá)量顯著升高。相同時(shí)間不同劑量處理?xiàng)l件下，處理3 h，LD10劑量處理表達(dá)量顯著下調(diào)，但LD30和LD50劑量處理表達(dá)量顯著升高；處理6 h，基因表達(dá)量均顯著下調(diào)；處理12 h，LD10劑量處理表達(dá)量顯著下調(diào)，但LD30劑量處理表達(dá)量顯著升高；處理24 和48 h，基因表達(dá)量均顯著升高，其中LD30劑量顯著誘導(dǎo)UGT33J12基因表達(dá)最高（見圖5）。

圖4 高效氯氟氰菊酯處理不同劑量和不同時(shí)間黏蟲UGT33J12基因相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Relative expression levels of UGT33J12 treated by different doses lambda-cyhalothtin under different time

圖5 氯蟲苯甲酰胺不同劑量和不同時(shí)間處理后黏蟲UGT33J12基因相對(duì)表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of UGT33J12 treated by different doses chlorantraniliprole under different treatment time

3 討論與結(jié)論

UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶參與動(dòng)物、植物、細(xì)菌和病毒等生物體內(nèi)各種化合物解毒。將核苷酸糖中糖基團(tuán)催化形成親水性化合物并有效排泄[31]。本試驗(yàn)基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定并克隆一條新黏蟲UDP-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因cDNA全長(zhǎng)序列，經(jīng)UGT國(guó)際命名委員會(huì)命名為UGT33J12，并登錄GenBank。經(jīng)序列相似性比對(duì)，與其他昆蟲UGT高度同源。

已有研究表明，UGTs 基因過(guò)度表達(dá)，有助于增強(qiáng)馬鈴薯葉甲對(duì)吡蟲啉的抗性[32]。棉鈴蟲經(jīng)啶蟲脒、吡蟲啉處理后，體內(nèi)葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶表達(dá)量升高，推測(cè)該酶過(guò)量表達(dá)參與昆蟲對(duì)殺蟲劑的解毒代謝[33]。通過(guò)抑制棉蚜體內(nèi)UGTs 活性，棉蚜對(duì)噻蟲嗪處理的敏感度顯著提高，說(shuō)明棉蚜UGT 基因在對(duì)噻蟲嗪抗性中發(fā)揮重要作用[14]。甜菜夜蛾脂肪體細(xì)胞經(jīng)高效氯氟氰菊酯、氯蟲苯甲酰胺等殺蟲劑處理后，顯著誘導(dǎo)UGT 基因表達(dá)，致使表達(dá)水平均明顯升高[34]。褐飛虱UGT-1-7和UGT2B10基因被抑制后，顯著降低對(duì)吡蟲啉抗性[35]。

本試驗(yàn)研究黏蟲UGT33J12 基因殺蟲劑誘導(dǎo)后表達(dá)情況，經(jīng)不同劑量與不同時(shí)間處理后，黏蟲UGT33J12 基因表達(dá)水平也有差異。不同劑量高效氯氟氰菊酯處理12 和24 h，UGT33J12 相對(duì)表達(dá)量均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，LD10處理48 h，基因表達(dá)也產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，說(shuō)明UGT33J12基因相對(duì)表達(dá)量提高與處理時(shí)間和劑量均有關(guān)系，UGT33J12 可能參與黏蟲對(duì)高效氯氟氰菊酯解毒作用。處理3 和6 h，基因表達(dá)量均出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象，可能是由于蟲體點(diǎn)滴藥劑后出現(xiàn)中毒現(xiàn)象，基因表達(dá)被抑制，短時(shí)間內(nèi)無(wú)法調(diào)節(jié)。利用不同劑量氯蟲苯甲酰胺處理24和 48 h， LD30、 LD50處 理 3 h， LD30處 理 12 h，UGT33J12 相對(duì)表達(dá)量均顯著上調(diào)，說(shuō)明氯蟲苯甲酰胺對(duì)黏蟲UGT33J12基因在不同時(shí)間和劑量處理下，同樣具有誘導(dǎo)效應(yīng)。處理6 h，各濃度相對(duì)表達(dá)量均被抑制，可能是在此時(shí)間段出現(xiàn)中毒反應(yīng)。本研究初步探索黏蟲UGT33J12基因功能以及高效氯氟氰菊酯和氯蟲苯甲酰胺對(duì)基因表達(dá)的影響，為了解黏蟲抗藥機(jī)制及應(yīng)用于黏蟲防治提供理論依據(jù)。