過氧化氫（H2O2）介導的光合誘導系統信號

姜佰文，許芳維，郝新雨，周笑竹，楊曉晗，李 威

（1.東北農業大學資源與環境學院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省寒地黑土保護與利用重點實驗室，哈爾濱 150030；3.東北農業大學生命科學學院，哈爾濱 150030）

光是植物光合作用重要因素，對植物生長及發育發揮重要作用[1]。農業生態系統中，由于冠層及葉片相互遮擋，大部分作物葉片處于遮蔽狀態[2]。研究表明，約80%光合有效輻射處于短期波動，光合有效輻射主要來自于光斑[3]。因此，高效利用該部分動態光能對農業生態系統植物至關重要[4]。葉片經充分暗適應，在一定光強照射下，其光合速率需經一段時間才達到最大值。光合速率上升過程，被稱為光合作用誘導過程[5]。如農作物冠層內部及底部葉片存在快速光合誘導過程，將對葉片充分利用短期動態光能發揮重要作用，實現農業生態系統中植物碳積累效率最優化。

植物體某些組織或器官受刺激后，向不受刺激組織或器官發出信號，使其表現出與刺激相對應生理狀態（Systemic signaling）[6]。Karpinski等發現擬南芥部分葉片受強光刺激后引發植株光破壞防御機制上調[7]；Lake等發現，擬南芥幼葉發育主要受成熟葉片所處環境影響[8]；王鑫等發現高粱新生葉片光合特性及解剖結構主要受老葉誘導，與自身所處光環境無關[9]；Hou 等發現酸模成熟葉片存在系統信號[10]。目前，系統信號研究多集中于擬南芥、高粱等模式作物，而關于玉米報道較少。Guo等報道，光照番茄莖尖促進IAA（吲哚乙酸）信號傳導光合作用系統誘導，觸發過氧化氫（H2O2）積累[11]。H2O2被認為是植物對脅迫反應信號信使[12]。Karpinski 等報道H2O2誘導擬南芥高光強脅迫下光保護作用增強[7]。研究還表明，H2O2是響應二氧化碳和臭氧所需長距離信號重要組成部分[13]。

玉米分布范圍廣，光合速率高，生物量大，受國內外學者關注。田強等研究表明玉米在我國農業種植中具有重要地位，對國內建設農業經濟戰略規劃有一定影響[14]。本試驗以玉米幼苗為材料，通過預先光照頂部葉片，測定葉片光合誘導過程快慢，明確農業生態系統中光合作用系統信號，為玉米如何高效利用動態光能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以玉米先玉335幼苗為試驗材料，種植在塑料盆中（直徑25 cm，高20 cm），土壤為草甸土，每盆種植1株，室外環境生長，待玉米幼苗長出4片成熟葉片、株高12～17 cm時測定。

試驗處理分為5組，試驗前，玉米幼苗用黑色不透明塑料布遮住葉片，試驗于次日8: 00 開始。5 個處理分別為：處理1，1 200 μmol·m-2·s-1PFD（Photon flux density）光強處理頂部成熟葉片40 min，其余葉片均保持遮光，然后測定底部葉片光合誘導過程以及過氧化氫含量（H2O2），以整株葉片全遮光底部葉片為對照；處理 2，1 200 μmol·m-2·s-1PFD光強處理底部成熟葉片40 min，其余葉片均保持遮光，然后測定頂部成熟葉片光合誘導過程及H2O2含量，以整株葉片全遮光頂部成熟葉片為對照；處理3，整株葉片經充分暗適應后，對底部葉片噴施10 mL 10 mmol·L-1過氧化氫溶液，以噴施10 mL 蒸餾水（H2O）為對照，經60 min 后，測定噴施H2O2和H2O 底部葉片光合誘導過程及H2O2含量；處理4，整株葉片經充分暗適應后，光照前用1 mL 10% 三氯乙酸（TCA）對頂部葉片基部處理10 h，然后1 200 μmol·m-2·s-1PFD光強處理最上端成熟葉片40 min，隨后測定底部葉片光合誘導過程及H2O2含量，以不施用TCA為對照；處理5，光照前0.5 mL 50 μmol·L-1二苯基碘化鉀（DPI）處理頂部葉片基部 15 min，然后 1 200 μmol·m-2·s-1PFD 光強處理最上端成熟葉片40 min，隨后測定底部葉片光合誘導過程及H2O2含量，以不施用DPI 為對照。處理葉片所用光源為可調式LED冷光源（英馳RB-101，北京）。

1.2 光合誘導曲線測定

采用LI-6400 便攜式光合儀（LI-COR, Lincoln,NE,USA）測定氣體交換參數。頂端目標葉片光照40 min后，在1 200 μmol·m-2·s-1PFD光強下測定目標葉片光合誘導過程，測定過程中光源由光合儀提供，CO2濃度保持 380 μmol·mol-1，溫度保持25 ℃，誘導時間為30 min，每60 s 自動測定1 次，并自動記錄結果。根據Hou等方法[10]，對光合測定值作標準化，將每次測定最大光合值設定為100%，其余測定值為：Pn（%）=實際測定值/最大值×100%。測定光合誘導曲線，每個處理選用3 盆長勢一致玉米幼苗作為重復。

1.3 葉片過氧化氫含量測定

將0.5 g葉片在液氮中研磨，并用5 mL 5%（W/V）三氯乙酸提取，將混合物以10 000 r·min-1離心5 min去除沉淀物。吸取3 mL上清液，加入0.4 mL 20%四氯化鈦和0.6 mL NH4OH，收集沉淀物，溶解于 2 mL 2 mol·L-1H2SO4中，415 nm 處測定吸光值。利用已知濃度H2O2溶液繪制標準曲線，計算測定溶液中H2O2濃度。

2 結果與分析

2.1 照射頂部葉片對底部葉片光合誘導過程的影響

1 200 μmol·m-2·s-1PFD光強預先照射玉米幼苗頂部成熟葉片后（見圖1A），由圖1 B可知，底部目標測定葉片光合誘導速率顯著升高，光合速率從最低值達到最高值所用時間低于對照組，可見，強光光照玉米最頂部成熟葉片對底部葉片產生信號作用，有效縮短其光合誘導過程。頂部葉片預先受到1 200 μmol·m-2·s-1PFD 強光照射后，底部葉片在光合誘導過程12 min，光合速率已接近最高水平，而對照組葉片在光合誘導過程25 min，其光合速率接近最高水平。在光合誘導分析過程中，為更清晰明確對比光合過程所用時間，本研究對比玉米幼苗葉片光合速率達到最大光合速率50%和90%所需時間T50和T90。結果見圖1C，玉米最頂部葉片預先受到 1 200 μmol·m-2·s-1PFD 光照后，底部葉片T50 和T90 極顯著低于對照組（P<0.01）。其中，處理組T50 降低29%，T90 降低37%。同時，預先光照頂部葉片后，底部葉片H2O2含量極顯著增加（P<0.01，見圖1D）。

圖1 預先光照玉米頂部葉片對玉米底部葉片光合誘導過程的影響Fig.1 Effect of pre-illuminating upper leaf on photosynthetic induction in the lower leaves of maize

2.2 照射底部葉片對頂部葉片光合誘導過程的影響

1 200 μmol·m-2·s-1PFD強光預先照射玉米幼苗底部葉片后（見圖2A），由圖2B可知，頂部目標測定葉片光合誘導速率無顯著升高，光合速率從最低值達到最高值所需時間與對照組一致，可見，強光光照玉米底部成熟葉片無法對頂部葉片光合誘導過程產生促進作用。由圖2C 可知，玉米底部葉片預先受到光照后，頂部葉片T50和T90與對照組無顯著差異（P>0.05）。由圖2D可知，預先光照底部葉片后，頂部葉片H2O2含量無顯著增加（P>0.05）。

圖2 預先光照玉米底部葉片對玉米頂部葉片光合誘導過程的影響Fig.2 Effect of pre-illuminating lower leaf on photosynthetic induction in the upper leaves of maize

2.3 噴施外源H2O2對底部葉片光合誘導的影響

玉米底部葉片噴施外源H2O2后（見圖3A），由圖3B 可知，在未預先光照頂部葉片情況下，底部葉片光合誘導速率顯著升高，表明外源H2O2有促進光合誘導過程的作用。底部葉片噴施外源H2O2處理（見圖3A）后，與底部葉片噴施H2O（見圖3B）對比，其T50 和T90 顯著降低（P<0.05，見圖3C）。同時，噴施H2O2后，底部葉片H2O2含量也極顯著增加（P<0.01，見圖3D）。

2.4 TCA 處理頂部葉片基部對底部葉片光合誘導過程的影響

TCA 處理頂部葉片葉柄后（見圖4A），即使頂部葉片預先受到1 200 μmol·m-2·s-1PFD 光照也并未促進底部葉片光合誘導速率（見圖4B）。TCA 可殺死韌皮部細胞，阻止物質通過韌皮部轉運，信號物質運輸途徑可能被阻斷。當頂部葉片被1 200 μmol·m-2·s-1PFD 光強照射后，TCA 處理頂部葉片后，底部葉片H2O2含量極顯著低于對照（P<0.01，見圖4D），同時，其T50 和T90 顯著高于對照（P<0.05，見圖4C）。TCA 可殺死韌皮部細胞，阻斷物質傳遞，表明H2O2可能通過韌皮部運輸。

2.5 DPI 處理頂部葉片基部對底部葉片光合誘導的影響

由圖5 可知，DPI 處理頂部葉片葉柄后（見圖5A），與TCA 結果相似，即使頂部葉片受預先1 200 μmol·m-2·s-1PFD 光照，也并未促進底部葉片光合誘導速率（見圖5B）。在頂部葉柄上施用DPI，在1 200 μmol·m-2·s-1PFD光照條件下，底部葉片T50、T90 以及H2O2含量仍受到抑制（見圖5C、D）。說明DPI 對H2O2發揮淬滅作用，光合誘導過程可能與H2O2有關，同時光合誘導過程也受抑制。

圖3 H2O2和H2O噴施玉米底部葉片對底部葉片光合誘導過程的影響Fig.3 Effect of lower leaves treated with H2O2 and H2O on photosynthetic induction in the lower leaves of maize

圖4 TCA處理玉米頂部葉片基部對底部葉片光合誘導過程的影響Fig.4 Effect of the base of upper leaves treated with TCA on photosynthetic induction in the lower leaves of maize

圖5 DPI處理玉米頂部葉片基部對底部葉片光合誘導過程的影響Fig.5 Effect of the base of upper leaves treated with DPI on photosynthetic induction in the lower leaves of maize

3 討 論

生長在冠層底部或冠層內部葉片，因不同位置遮擋、空氣擾動及云層遮擋等因素，難以保證持續穩定光照，一般情況為光斑照射[15-16]。研究表明，光層底部葉片接受光能70%以上屬于短期波動光斑。所以，高效利用這部分短暫光能，是光層底層植物生存關鍵[17]；同時，高效利用這部分短暫光能，對冠層底部或冠層內部葉片碳積累具有重要意義[18-19]。研究表明，冠層底部葉片具有較高Rubisco 活化酶活性，所以其具有較快光合誘導過程[20]。然而，因較高Rubisco 活化酶活性依賴于較高ATP/ADP 比率，維持較高Rubisco活化酶活性需消耗較多能量[21-22]。因此，遮陰狀態下，維持較高Rubisco 活化酶活性造成植物消耗能量巨大。光斑僅覆蓋植物較小部分，同時光斑也可能轉移至植株其他部分，通過預先光照冠層頂部葉片產生的系統信號，可使其他葉片準備好預期光照，植物可能以最小的代價高效利用光斑。所以，系統調控對植物光合誘導具有至關重要的作用。

目前，Karpinski 等[7]、Lake 等[8]、Hou[10]等已發現擬南芥和酸模葉片存在長距離信號傳遞，擬南芥新生葉片解剖結構主要由老葉所處光環境決定，而與自身所處光環境關系不顯著；而酸模成熟葉片之間，也存在光合誘導系統信號。本試驗表明，預先光照玉米頂部葉片可促進中部和底部葉片光合誘導過程，表明玉米也存在光合誘導信號。這種信號對草本植物具有重要意義，使葉片更高效利用光能，增加碳同化量。但關于信號傳遞途徑，尚不清楚。相關研究認為信號物質可能是通過木質部、韌皮部運輸到目的組織或器官[23-24]，也有研究認為是電訊號[25]。TCA 殺死韌皮部細胞，使物質無法通過韌皮部運輸。

4 結論

從試驗結果可見，玉米成熟葉片之間存在系統信號，這種信號顯著提高光合誘導過程，提高玉米葉片對光斑利用效率。本試驗研究表明，TCA處理頂部葉片后，即使頂部葉片受到強光照射，也無法促進底部葉片光合誘導過程。所以，光合誘導信號可能通過韌皮部介導。強光照射頂部葉片，使底部葉片H2O2含量升高；TCA 處理頂部葉片基部，即使頂部葉片照射強光也無法增加底部葉片H2O2含量，表明H2O2是通過韌皮部轉運，同時，也抑制底部葉片光合誘導過程，表明H2O2可能是信號物質。為進一步證明H2O2信號物質作用，利用DPI處理頂部葉片基部，發現DPI處理后，即使頂部葉片照射強光也無法增加底部葉片H2O2含量，同時，也抑制底部葉片光合誘導過程。DPI可猝滅H2O2，進一步表明，H2O2在光合誘導中的信號物質作用，且信號具有方向性，僅從上至下傳導。