響應面法優化玉米醇溶蛋白提取工藝及抗氧化活性評價

王 巖，王建宇，于 璐，袁鳳娟，張 萌，吳紅艷，高建偉，王拓一

（齊齊哈爾大學食品與生物工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006）

玉米籽粒中主要儲存蛋白為醇溶蛋白，占玉米胚乳蛋白質總量35%～60%[1-2]。玉米醇溶蛋白是由大量非極性氨基酸組成的帶正電荷疏水性蛋白質，易溶于乙醇水溶液，是玉米深加工最重要的工業副產物之一[3]。玉米醇溶蛋白主要存在于玉米濕法加工制備淀粉過程剩余物玉米蛋白粉（玉米黃粉）中[4-5]。雖然玉米醇溶蛋白缺乏以賴氨酸和色氨酸為代表的必需氨基酸，營養價值降低，且不溶于水，但因其特殊的氨基酸組成和物化性質，可塑性、涂膜性、可降解性和抗氧化性較好等，可用于果蔬保鮮、食品包裝、可降解材料制備等生產活動[5-6]。在特種食品、制藥和生物可降解塑料工業中應用前景廣泛[7-8]。

目前，玉米醇溶蛋白提取主要方法包括異丙醇提取法[9]、乙醇提取法[10-11]、超聲波輔助提取法[12]和微波提取法[13]等。在提取過程中，提取條件對玉米醇溶蛋白結構產生一定影響，最終影響其應用性質，如抗氧化性[14-15]。因此，從成本和應用兩方面，優化提取條件，更有利于醇溶蛋白加工利用。

Cook 等對比不同有機溶劑對玉米醇溶蛋白影響，結果表明提取從高到低依次為乙酸、60%異丙醇、90%乙醇和80%乙醇，說明不同有機溶劑和濃度影響提取率，并指出采用兩種溶劑系統提取更便于玉米醇溶蛋白回收[16]。張媛媛研究結果表明，利用微波輔助提取工藝，極大縮短提取時間，降低生產成本，但因于過程中內部溫度驟升，改變蛋白質結構，影響加工性能[13]。Gu 等采用超聲波輔助提取玉米醇溶蛋白，提高提取效率，降低提取溫度，同樣對蛋白質微觀結構造成一定程度影響，提取的玉米醇溶蛋白純度高[17]。任曉峰等研究表明，超聲波輔助處理增加玉米醇溶蛋白水溶性，顯著提高提取效率[18]。目前工業上大規模制備玉米醇溶蛋白主要以乙醇為提取溶劑，通過物理和生物技術等手段輔助提高提取效率，一定程度上改變玉米醇溶蛋白結構和功能。

本文以玉米蛋白粉為原料，選取超聲波輔助提取，選擇提取溫度、提取時間、乙醇濃度、pH和固液比5個因素作單因素試驗，再通過響應面試驗設計法優化提取過程參數，確定最佳提取工藝，評價已提取醇溶蛋白抗氧化活性，以期為醇溶蛋白提取、加工和利用提供基礎試驗數據，為工業化生產工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米黃粉（購自齊齊哈爾阜豐生物科技有限公司），無水乙醇、氫氧化納、鹽酸、DPPH、ABTS+·、硫酸亞鐵、水楊酸、過硫酸鉀和抗壞血酸等均為分析純（購自阿拉丁試劑上海有限公司）。

1.2 儀器設備

SK3300HP 超聲波清洗機（購自上海科導超導儀器有限公司），SH2-D 循環水式真空泵（購自鞏義市英峪予華儀器廠），DF-Ⅱ集熱式磁力攪拌器（購自江蘇省金環市醫療儀器廠），DHG-9145A 電熱恒溫古風干燥箱（購自上海一恒科技有限公司），步琦K370 全自動凱式定氮儀（購自瑞士步琦有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 玉米醇溶蛋白提取工藝流程

玉米蛋白粉→過篩（80 目）→加入乙醇→調pH、溫度→超聲波輔助提取（功率180 W）→離心分離→上清液→凍干→醇溶蛋白

1.3.2 玉米醇溶蛋白提取率測定

玉米醇溶蛋白提取率（%）=提取玉米醇溶蛋白質量（g）/玉米黃粉質量（g）×100%

1.3.3 玉米醇溶蛋白純度測定

采用GB 5009.5-2016測定[19]。

1.3.4 響應面試驗設計

乙醇濃度、固液比、pH、提取時間4 個因素為自變量，分別以x1、x2、x3、x4表示，根據現有試驗條件及相關前期試驗，確定其取值為60%～90%、1∶4～1∶13 g·mL-1、30～90 min。按方程Xi=(x1-x0)/Δx對自變量編碼，并以自變量編碼值+1、0、-1分別代表自變量高、中、低水平。玉米醇溶蛋白提取率YA為響應值，試驗自變量因素編碼及水平見表1。

表1 響應面試驗自變量因素編碼及水平Table 1 Code and level of independent variables in response surface test

1.3.5 DPPH自由基清除率測定

參照Zhang 等方法測定[20]，略有改動：新鮮制備DPPH 溶液（0.1 mmol·L-1），將其保存在蓋有鋁箔燒瓶中，兩次測量之間保證4 ℃黑暗環境。在0.1 mmol·L-1DPPH 溶液中，將 2 mL 醇溶蛋白，加入到0.2 mL 提取液中并劇烈搖動。然后將試管在黑暗中放置室溫30 min。同時制備DPPH 對照樣品，并將乙醇用于空白。使用紫外可見分光光度計測量517 nm 處吸光度降低。記錄吸光度降低百分比，基于觀察到的自由基吸收度降低以計算DPPH自由基清除百分比。

1.3.6 ABTS+·自由基清除率測定

參照Al-Weshahy 等方法測定[21]，略有改動：通過將 ABTS 溶液（7 mmol·L-1）與 13.24 mg 過硫酸鉀混合16 h，生成ABTS 自由基。將所得溶液冷藏、稀釋，在734 nm 處吸光度為0.70。將100 mL樣品與1.9 mL ABTS+·混合，然后放置7 min后，在734 nm處測量吸光度。

1.3.7 羥基自由基清除率測定

參照Fenton反應方法建立反應體系模型[22]，略有改動。反應混合物由10 mmol·L-1FeSO4-EDTA（0.15 mL），10 mmol·L-1H2SO（40.15 mL），0.15 mL H2O 和 0.15 mol·L-1磷酸鈉緩沖液（pH 7.4，0.3 mL）。添加樣品溶液（提取物，0.15 mL）后，將合并混合物在37 ℃下反應10 min，然后通過添加1%巴比妥酸（0.7 mL）和2.8%三氯乙酸（0.7 mL）終止反應。將該溶液在水浴中加熱5 min，然后冷卻至25 ℃。與抗壞血酸比較，在510 nm 處讀取混合溶液吸光度（陽性對照）。根據以下方程式，以百分比形式分析影響。

1.3.8 自由基清除率計算公式

使用以下公式計算DPPH、ABTS+·、羥基自由基清除率。

K=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

1.3.9 數據分析與處理

試驗數據均平行測定3 次，采用Design-Ex?pert 8.0.6、SPSS 19.0軟件分析所得數據。

2 結果與分析

2.1 提取溫度對玉米醇溶蛋白提取率的影響

在80%乙醇濃度，固液比1∶10 g·mL-1，pH 12，超聲波輔助處理30 min，分別在30～80 ℃下提取，研究溫度對提取率的影響，結果見圖1。

一般來說，溫度升高有利于溶質宏觀傳質速率，溫度較低時，提高溫度增加分子動能，提高溶質擴散速率，增加醇溶蛋白提取率。由圖1 可知，由30 ℃升至60 ℃時玉米醇溶蛋白提取率不斷提高，當溫度升至70 ℃及以上時提取率明顯下降，產生這種現象可能是因溫度過高導致部分蛋白變性，使醇溶蛋白在乙醇溶液中溶解度降低。

圖1 提取溫度對玉米醇溶蛋白提取率的影響Fig.1 Influence of extraction temperature on the extraction rate of zein

2.2 提取時間對玉米醇溶蛋白提取率的影響

在80%乙醇濃度，固液比1∶10 g·mL-1，pH 12，溫度70 ℃，超聲波輔助處理20～120 min 條件下提取原料，研究提取時間對提取率的影響，結果見圖2。

圖2 提取時間對玉米醇溶蛋白提取率的影響Fig.2 Influence of extraction time on the extraction rate of zein

醇溶蛋白在乙醇溶液中溶解及擴散均需一定時間，隨提取時間增加，有利于蛋白質顆粒完全浸取，更易破壞醇溶蛋白和其他物質結合，促使在乙醇溶液中溶解，但隨時間增加，浸取速度下降，提取率將逐步保持恒定。由圖2可知，隨超聲時間增加，醇溶蛋白提取率逐漸增加，當提取時間增至80 min以上時，提取率增加緩慢。

2.3 乙醇濃度對玉米醇溶蛋白提取率的影響

在固液比1∶10 g·mL-1，pH 12，溫度70 ℃，超聲波輔助處理80 min，乙醇濃度50%～100%條件下提取原料，研究乙醇濃度對提取率的影響，結果見圖3。

圖3 乙醇濃度對玉米醇溶蛋白提取率的影響Fig.3 Influence of ethanol concentration on the extraction rate of zein

由圖3可知，隨乙醇濃度增加，醇溶蛋白提取率先增后降，乙醇濃度為70%時提取率最大。此時因70%濃度乙醇極性與醇溶蛋白接近，根據相似相容原理，提取率達最大值。

2.4 pH對玉米醇溶蛋白提取率的影響

在固液比1∶10 g·mL-1，乙醇濃度70%，溫度70 ℃，超聲波輔助處理 80 min，pH 8～13 提取原料，研究pH對提取率的影響，結果見圖4。

圖4 pH對玉米醇溶蛋白提取率的影響Fig.4 Influence of pH on the extraction rate of zein

由圖4 可知，不同pH 對醇溶蛋白提取率影響較大，隨pH 逐漸增大，提取率呈先增后減趨勢，原因可能為堿性條件有利于增加醇溶蛋白溶解性，但pH過高破壞蛋白質結構，反應在強堿條件下提取率反而下降的趨勢。

2.5 固液比對玉米醇溶蛋白提取率的影響

在乙醇濃度70%，溫度70 ℃，超聲波輔助處理80 min，pH 11，固液比1∶8～1∶18 g·mL-1條件下提取原料，研究固液比對提取率的影響，結果見圖5。

由圖5可知，隨固液比增加，醇溶蛋白提取率逐漸增加，原因在于隨溶劑增加，醇溶蛋白大量暴露于乙醇水溶液，便于游離，但一旦溶劑溶解溶質達到飽和，提取率不再增加。

圖5 固液比對玉米醇溶蛋白提取率的影響Fig.5 Influence of solid-liquid ratio on the extraction rate of zein

2.6 玉米醇溶蛋白提取工藝模型建立及其顯著性檢驗

利用Design Expert 8.0.6 軟件建立試驗設計及試驗結果見表2。對表2 中試驗數據作回歸分析，得到二次多元回歸方程（模型）為:

表3為模型方差分析結果，表4為模型顯著性檢驗結果。對方程F檢驗可得出，失擬檢驗得到F失擬=0.52F0.01（14，4）=2.39，檢驗極顯著，說明方程與實際情況擬合良好，可反映提取率與4 個因素之間關系，同時，復相關系數R2=0.9672，可分析和預測提取玉米醇溶蛋白提取工藝。

表4 為回歸系數取值及方差分析結果，可知，x2、x1x4和x1x3項對提取率影響極顯著，x1，x3x4對提取率影響顯著，其他因素影響不顯著。通過回歸系數絕對值，得出提取率影響順序為固液比>乙醇濃度>提取時間>pH。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Response surfacex test design and results

表3 回歸模型顯著性分析Table 3 Significance analysis of regression model

表4 回歸方程系數顯著性檢驗Table 4 Significance test of regression equation coefficients

2.7 玉米醇溶蛋白提取率中各因素交互作用分析

由圖6 可知，pH 不變，隨乙醇濃度增加，玉米醇溶蛋白提取率呈先增后降趨勢；當乙醇濃度不變，pH 6～12 不斷變化時，增大pH，提取率升高，當pH 達到中性時提取率增加趨于平緩并呈下降趨勢，原因在于堿性條件有利于醇溶蛋白在乙醇溶液中溶出。

由圖7可知，時間不變，隨乙醇濃度增加，提取率呈先升后降趨勢；當乙醇濃度恒定，時間在30～90 min 內變化，隨時間延長提取率逐漸增加，最大提取率達22.51%，當時間達一定數值時，提取率趨于平緩。因本試驗采用超聲波輔助提取，超聲波作用可有效打破溶質和溶劑邊界層，加速媒介細化和混合，隨時間增加，提高萃取速率。

圖6 pH和乙醇濃度對提取率影響的等高面和響應曲面圖Fig.6 Influence of pH and ethanol concentration on the extraction rate of isometric surface and response surface

圖7 乙醇濃度、提取時間對提取率影響的等高面和響應曲面圖Fig.7 Influence of ethanol concentration and extraction time on the extraction rate of isometric surface and response surface

由圖8 可知，時間不變，隨pH 逐步增加，玉米醇溶蛋白提取率液逐步增加，當pH達到一定值時，提取率呈下降趨勢，這是由于玉米醇溶蛋白在中性或是偏堿性溶液中溶解性更好，酸堿性過強反而降低溶解度；當pH 不變，在30～90 min 范圍內，隨時間延長提取率增加，而當時間達到一定數值時，提取率呈下降趨勢。

由圖9 可知，當固液比不變，隨乙醇濃度增加，提取率隨之增加，而當乙醇濃度繼續升高，提取率反而呈下降趨勢。可能是由于含高比例非極性氨基酸玉米醇溶蛋白和其含有的其他氨基酸共同作用，在水或無水乙醇中的溶解度出現反復現象，隨乙醇濃度變化，醇溶蛋白溶解性也發生改變；當乙醇濃度一定，固液比在4～13 g·mL-1內變化，隨固液比增加玉米醇溶蛋白提取率逐漸增加。

由圖10可知，pH不變，隨固液比增加，玉米醇溶蛋白提取率逐步增加。因增加溶劑用量，有利于玉米醇溶蛋白在其中更充分溶解，然而不斷增加溶劑用量，溶解度增長趨勢急劇變小，從成本考慮，利用增加固液比提高產率并不經濟；當固液比不變，pH 6～9 內變化，提取率不斷增加，再持續增加pH，提取率呈下降趨勢。

由圖11 可知，當時間保持恒定，固液比增加，提取率逐步增加；當固液比不變，時間在30～90 min內變化，時間增加，提取率增加，當時間達到某一時刻，提取率呈輕微下降趨勢。可能是由于時間增加，原料在溶劑中更好溶解，但提取時間過長，原料中蛋白發生變性等，親水基團暴露，導致提取率出現下降。

圖8 pH和提取時間對提取率影響的等高面和響應曲面圖Fig.8 Influence of pH and extraction time on the extraction rate of isometric surface and response surface

圖9 乙醇濃度、固液比對提取率影響的等高面和響應曲面圖Fig.9 Influence of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the extraction rate of isometric surface and response surface

圖10 pH、固液比對提取率影響的等高面和響應曲面圖Fig.10 Influence of pH and solid-liquid ratio on the extraction rate of isometric surface and response surface

圖11 時間、固液比對提取率影響的等高面和響應曲面圖Fig.11 Influence of extraction time and solid-liquid ratio on the extraction rate of isometric surface and response surface

2.8 響應面方程驗證

通過Design-Expert 軟件得出最佳提取工藝為：乙醇濃度82.86 %，固液比1∶13 g·mL-1，pH 11.56，時間83.07 min，該條件下，提取率最大值為28.33%。根據實際操作，將最佳條件變為乙醇濃度80%、固液比1∶13 g·mL-1、pH 11.56、提取時間83 min，實際提取率為27.87%，理論預測與實際提取誤差為1.6%，此時醇溶蛋白純度為92.47%。

2.9 提取醇溶蛋白抗氧化評價

對提取出的醇溶蛋白作DPPH、ABTS+·和羥自由基清除能力如圖12～14所示。已提取醇溶蛋白具有清除3種自由基作用，濃度2～10 mg·mL-1時，對DPPH、ABTS+·和羥自由基清除率分別為30.12%～50.36%、20.12%～50.66%、22.12%～68.76%，抗壞血酸作為陽性對照其抗氧化能力如圖所示。

圖12 不同濃度醇溶蛋白和抗壞血酸對DPPH自由基清除率Fig.12 DPPH free radical scavenging rates of different concentrations of zein and ascorbic acid

圖13 不同濃度醇溶蛋白和抗壞血酸對ABTS+·自由基清除率Fig.13 ABTS+·scavenging rates of different concentrations of zein and ascorbic acid

圖14 不同濃度醇溶蛋白和抗壞血酸對羥自由基清除率Fig.14 Hydroxyl free radical scavenging rates of different concentrations of zein and ascorbic acid

3 討論與結論

從玉米蛋白粉中提取高品質玉米醇溶蛋白，有利于醇溶蛋白后續加工利用，傳統工業主要以有機溶劑作為萃取劑，雖然丙酮和異丙醇提取效果略優于乙醇，但存在毒性較大，回收成本和損失率高等缺點，采用乙醇水溶液提取醇溶蛋白是目前主流提取方式[19]。

超聲波輔助提取工藝，操作簡單，熱能消耗低，成本低，提取時間短，李麗杰等[11]，李娜等[23]，王緲等[24]，趙華等[25]，均利用超聲波輔助提取方式優化玉米醇溶蛋白提取工藝，但在試驗設計過程中pH 對試驗結果的影響未納入研究因素。Liu 等研究結果表明，堿性條件有利于醇溶蛋白在乙醇水溶液的提取[9]，本研究結果也表明，堿性條件下有利于提高提取率。

雖然和抗壞血酸比，提取得到的醇溶蛋白抗氧化能力有一定差距，但隨醇溶蛋白濃度增加，對3種自由基的清除也逐漸提高，提取得到的醇溶蛋白具有較強自由基清除能力，可解釋醇溶蛋白產生應用價值的原因，如油脂抗氧化性。在提取過程中不同提取條件改變醇溶蛋白微觀結構，影響玉米醇溶蛋白提取工藝，因此，后續試驗應對玉米醇溶蛋白在加工過程中結構變化和后續加工特性影響作為研究方向。

本文在單因素試驗基礎上，對提取溫度、提取時間、pH、固液比和乙醇濃度因素作Box-Behnken響應面分析，得到最佳提取條件為，乙醇濃度80%、固液比1∶13 g·mL-1、pH 11.56、超聲時間83 min，提取溫度70 ℃，各因素對提取率影響依次為固液比>提取率>乙醇濃度>提取時間>pH；采用DPPH、ABTS+·和羥基自由基3 種方法評價提取的玉米醇溶蛋白抗氧化能力，表明提取的玉米醇溶蛋白具有一定自由基清除能力。以上結果為進一步利用玉米加工副產物提供工藝參考，也為更好開發醇溶蛋白生物活性和加工領域提供參考。