體外產氣法評價榆樹葉在反芻動物日糧的應用

袁 玖，柳 振，代春輝，王春卉，楊 帆，陳國順，萬欣杰

（1.甘肅農業大學動物科學技術學院，蘭州 730070；2.蘭州聯邦飼料有限公司，蘭州 730060）

榆樹（Ulmus pumilaL.），又名春榆、白榆、家榆、榆錢等，分布于中國東北、華北、西北及西南各省區。榆樹葉（Elm leaves，E）資源豐富，取材方便。新鮮榆樹葉含粗蛋白質7.5%，無氮浸出物14%，富含礦物質和胡蘿卜素。一般于7～9月采收榆樹葉，摘取其2/3部分，避免折斷樹枝[1]。榆樹葉青喂、打漿喂或風干處理后，添加干精飼料（地瓜面、玉米面、高粱面）飼喂生豬，可防病促生長，但單獨飼喂無法完全滿足動物營養需要。通過與苜蓿（Medicago sativa）等飼料搭配使用，可發揮飼料間正的組合效應（Associative effects，AE），改變動物胃腸道代謝過程[2-3]。谷草∶苜蓿按50∶50 配比時，AE 最優[4]。玉米秸稈∶苜蓿按50∶50、60∶40、燕麥干草∶玉米秸∶苜蓿按10∶50∶40、20∶50∶30 配比時，體外發酵參數和AE 最高[5]。研究表明，苜蓿與低質粗飼料搭配可改善飼料利用率，發揮飼料間AE 正向作用[6]。精料與秸稈類、禾本科牧草配比后綜合AE 指數（Multiple-factor AE index，MFAEI）均 >1， 為 1.273～1.620， 而 精 料 與 苜 蓿MFAEI 為0.819[7]。精料∶羊草∶玉米秸青貯∶燕麥草為 50∶15∶10∶25 時，MFAEI 最佳[8]。目前，榆樹葉未得到充分利用，尚未見其應用于反芻動物飼糧。本研究旨在利用體外產氣法測定不同精粗比下榆樹葉與苜蓿、精料搭配組合后單項和組合效應，獲得正AE較優組合，為養殖生產中榆樹葉應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

精料、苜蓿購于蘭州聯邦飼料有限公司，榆樹葉采集于蘭州市植物園。精料配方組成（風干基礎）∶玉米（Zea maysL.）85.00%，豆粕7.75%，棉粕3.10%，食鹽1.65%，復合預混料2.50%。

試驗用產氣管為德國制造100 mL 玻璃注射器（最小刻度1 mL）。

1.2 試驗設計

試驗以精粗比設為 60∶40、50∶50、40∶60、30∶70、20∶80。精料∶榆樹葉∶苜蓿20 個配比，精料∶榆樹葉5 個配比，3 種原料單獨培養，共計28種飼糧組合，每組7 個重復，共培養196 個產氣管。試驗分3批，每批設3個空白對照，消除體外培養系統誤差。具體飼糧配比見表1。

表1 28種飼糧組合比例Table 1 Proportion of 28 kinds of diets combination

1.3 瘤胃液供體動物及飼養

試驗用瘤胃液采自年齡約4.5 歲、體重（500±2.9）kg安裝永久瘤胃瘺管的6頭荷斯坦奶牛，自由采食麥秸，精料5 kg·d-1·頭-1，日喂3 次，自由飲水。精料組成和營養水平見表2[9]。早飼前采集6頭牛瘤胃液，混合后4 層紗布過濾至暖瓶，通入CO2保持厭氧，待用。

1.4 體外發酵培養程序

榆樹葉、精料、苜蓿3 種原料，干燥、粉碎、過1 mm 標準篩。準確稱取28 種飼糧組合0.2000 g（DM 基礎），置于3 cm×5 cm 400 目尼龍袋，扎緊，置產氣管，將39 ℃微生物培養液30 mL（10 mL 瘤胃液+20 mL緩沖液，緩沖液配制參照Menke等[10]方法）加入產氣管，推出管內空氣，密封乳膠管一端，讀數，記錄產氣管初始刻度（mL，GP0）后，置于39 ℃恒溫水浴鍋，在培養2、4、6、9、12、24、36、48、72 h 時，分別記錄各時間點產氣量（Gas production，GP，mL）。某飼糧組合在某時間點GP=該段時間樣品管GP-樣品管0 h時初始讀數（GP0h）-該段時間空白管GP空白。

表2 瘺管荷斯坦奶牛日糧中精料的配方組成和營養水平（%，DM基礎）Table 2 Ingredients and nutritional levels of the concentrate of the experimental diet for Holstein-Friesian cows(%,DM basis)

1.5 上清液及殘渣采集

72 h培養結束后，用蒸餾水洗凈尼龍袋，105 ℃烘48 h 至恒重，測定干物質降解率（Dry matter digestibility,DMD）。殘渣測定粗灰分，計算有機物降解率（Organic matter digestibility，OMD）。培養液5 000×g 離心10 min，上清液移至離心管，-20 ℃保存，待測揮發性脂肪酸（Volatile fatty acids，VFA）和氨態氮（NH3-N）。

1.6 測定指標及方法

1.6.1 飼料常規營養水平

榆樹葉、苜蓿、精料干物質（Dry matter，DM）、粗蛋白質（Crude protein，CP）、粗脂肪（Ether ex?tract，EE）、粗纖維（Crude fiber，CF）和粗灰分（Crude ash）含量采用美國分析化學家協會（Associ?ation of Official Analytical Chemists，AOAC）[11]概略養分法測定。

1.6.2 產氣指標計算

①GP測定。GPt=200×(Vt-V0)/W

式中，t為發酵開始后某一時間（h）；GPt為樣品t時刻產氣量（mL）；Vt為樣品發酵t小時后產氣管讀數；Vo為開始培養時空白管讀數；W為樣品干物質重量（mg）。

②產氣參數計算。利用“fit curve”軟件，Фrskov等產氣模型公式GP=a+b（1-e-ct）[12]，將2、4、6、9、12、24、36、48、72 h 時GP 代入，計算a、b、c等消化動力參數。式中，t為發酵開始后某一時間（h）；a為快速產氣量（mL）；b為緩慢產氣量（mL）；c為b產氣速度常數（%·h-1）；（a+b）為潛在產氣量（mL）。

1.6.3 瘤胃發酵參數、DMD、OMD測定

采用梅特勒-托利多FE20 型酸度計測定pH；采用Lu等[13]氣相色譜法測定VFA濃度。采用Brod?erick 和Kang[14]方法測定NH3-N 濃度；干物質降解率（DMD，%）=（原樣品重量×原DM含量-殘渣樣品重量×殘渣 DM 含量）/原樣品重量×原 DM 含量×100%；有機物降解率（OMD，%）=（原樣品重量×原OM含量-殘渣樣品重量×殘渣有機物含量）/原樣品重量×原有機物含量×100%。

1.6.4 組合效應計算

單項組合效應指數（Single-factor associative ef?fects index，SFAEI）和綜合組合效應指數（Multiplefactor associative effects index，MFAEI）參照方法[15]。

SFAEI=（各組合實測值-加權估算值）×100/加權估算值

式中，實測值為各組合實際測定值，加權估算值=精料實測值×精料配比（%）+榆樹葉實測值×榆樹葉配比（%）+苜蓿實測值×苜蓿配比（%）。

1.7 數據處理與統計分析

試驗數據采用SPSS 16.0 軟件作單因子方差分析，結果以平均值和平均標準誤（Standard error of Mean，SEM）表示，以P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。差異顯著時，用Tukey氏法作多重比較。

2 結果與分析

2.1 單一飼料營養水平及體外產氣參數

由表3 可知，榆樹葉（11.2%）CP 小于精料（19.5%）和苜蓿（19.9%）；在EE 和CF 上，榆樹葉均小于苜蓿，大于精料。精料和苜蓿快速產氣部分a（-9.8 mL、-3.7 mL）為負值，存在產氣滯后效應；榆樹葉a 值為5.7 mL，產氣不滯后。榆樹葉（52.8 mL、50.3 mL）潛在產氣量（a+b）、72 h 產氣量 GP72h均高于精料（45.0 mL、42.5 mL）和苜蓿（27.2 mL、26.1 mL）。

表3 飼料營養水平及體外產氣參數（絕干基礎）Table 3 Nutritional levels and in vitro gas parameters of experimental diets(Dry matter basis)

2.2 各飼糧組合產氣參數及發酵指標

由表4～5 可知，不添加苜蓿時，精料∶榆樹葉（C∶E）為80∶20、60∶40 組a、b、c、DMD、OMD、乙酸、丙酸、丁酸、總揮發性脂肪酸（Total volatile fatty acids，TVFA）均顯著高于其他組（P<0.05），NH3-N、GP72h、（a + b）均極顯著高于其他組（P<0.01），50∶50組丁酸顯著高于40∶60、20∶80組（P<0.05），50∶50組乙酸、TVFA、GP72h、a、（a+b）與其他組無顯著差異（P>0.05）。20∶80、40∶60和50∶50 組pH 顯著高于80∶20、60∶40（P<0.05）。C∶R 為60∶40時，精料60%，榆樹葉和苜蓿共40%。榆樹葉∶苜蓿（E∶A）為10∶30 組（榆樹葉配比為10%，簡稱“10 組”，下同）a、戊酸顯著高于 30 組（P<0.05），10組c、乙酸、丙酸、異戊酸和TVFA顯著高于 20、30 組（P<0.05），10 組（a+b）、DMD、OMD 極顯著高于其他組（P<0.01），10 組GP72h極顯著高于 30∶10 組（P<0.01），10、20 榆樹葉組 b、NH3-N均顯著高于30組（P<0.05），10組pH顯著低于其他組（P<0.05）。

C∶R為50∶50時，精料50%，榆樹葉和苜蓿共50%。E∶A 為 20∶30 組（簡稱“20 組”）a、NH3-N 顯著高于30、40 組（P<0.05），20 組 b 顯著高于 40 組（P<0.05）；20、10 組c、戊酸、異戊酸顯著高于30、40 組（P<0.05）；20 組（a+b）、GP72h極顯著高于其他組（P<0.01），且30、10 組極顯著高于40 組（P<0.01）；20、10 組DMD、OMD 極顯著高于其他組（P<0.01）；20、10 組 pH 顯著低于其他組（P<0.05）；20組乙酸、丙酸、TVFA顯著高于其他3組（P<0.05）。

C∶R為40∶60時，精料40%，榆樹葉和苜蓿共60%。40 榆樹葉組a、c、（a + b）極顯著高于50、30、10 組（P<0.01）；40 組 GP72h、NH3-N、乙酸、丙酸顯著高于50、30、10 組（P<0.05）；40、30 組b、DMD 極顯著高于其他3 組（P<0.01）；40、30 組OMD、丁酸、異戊酸、戊酸顯著高于其他組（P<0.05）；40 組TVFA 顯著高于其他組（P<0.05），且30 組顯著高于50、20、10 組（P<0.05）；40、30 組pH 顯著低于其他 3 組（P<0.05）。C∶R 為30∶70 時，精料30%，榆樹葉和苜蓿共70%。55、40 榆樹葉組a、c、乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸、TVFA均顯著高于25、10 組（P<0.05）；55、40 組b、（a+b）、GP72h、DMD、OMD、NH3-N 均極顯著高于25、10 組（P<0.01）。C∶R 為20∶80 時，精料20%，榆樹葉和苜蓿共80%。20 榆樹葉組a、c、乙酸、丙酸、TVFA 顯著高于 65、50 組（P<0.05）；20 組DMD、OMD 極顯著高于65、50 組（P<0.01）；20 組丁酸、異戊酸顯著高于其他組（P<0.05）；20 組b、（a+b）、GP72h、NH3-N 極顯著高于其他組（P<0.01），且50 組（a+b）、GP72h極顯著高于65、50組（P<0.01）；20組pH顯著低于其他組（P<0.05）。

表4 榆樹葉與苜蓿、精料混合體外培養72 h后產氣及發酵參數Table 4 GP and fermentation parameters at 72 h when elm leaves was incubated with alfalfa,concentrate in vitro

表5 榆樹葉與苜蓿、精料混合體外培養72 h后揮發性脂肪酸含量Table 5 Volatile fatty acids at 72 h when elm leaf was incubated with alfalfa and concentrate in vitro (mmol·L-1)

2.3 各飼糧組合單項組合效應值和綜合組合效應值

由表6可知，不添加苜蓿時，精料∶榆樹葉（C∶E）為 80∶20、60∶40 組 5 個 SFAEI（GP72h、DMD、OMD、TVFA、NH3-N 的AE）和MFAEI 極顯著或顯著高于其他3 組（P<0.01，P<0.05）。C∶R 為60∶40時，榆樹葉：苜蓿（E∶A）為10∶30、20∶20 組GP72h和TVFA的AE極顯著高于30∶10組（P<0.01）。10∶30組 DMD 的 AE 極顯著高于 20：20、30：10 組（P<0.01），10∶30 組 OMD 和 NH3-N 的 AE 極顯著高于30∶10 組（P<0.01）。在MFAEI 上，10∶30 組極顯著高于20∶20、30∶10組（P<0.01），20∶20組極顯著高于30∶10組（P<0.01）。

表6 榆樹葉與苜蓿、精料混合體外培養72 h后SFAEI和MFAEITable 6 SFAEI and MFAEI after fermentation for 72 h when elm leaves was incubated with alfalfa and concentrate in vitro

由表6 可知，C∶R 為50∶50 時，E∶A 為20∶30、10∶40組GP72h、OMD的AE極顯著高于30∶20、40∶10 組（P<0.01）；20∶30 組 DMD 的 AE 極顯著高于其他組（P<0.01）；20∶30 組NH3-N 的AE 顯著高于其他組（P<0.05），10∶40組顯著高于30∶20、40∶10組（P<0.05）；在 TVFA 的 AE 和 MFAEI 上，20∶30 組極顯著高于其他組（P<0.01），10∶40組極顯著高于30∶20、40∶10 組（P<0.01）。C∶R 為 40∶60 時，E∶A為 40∶20 組的 GP72h、DMD 的 AE 極顯著高于 50∶10、20∶40、10∶50 組（P<0.01）；在OMD、TVFA、NH3-N 的 AE 和 MFAEI 上，40∶20 組極顯著高于其他組（P<0.01），30∶30 組極顯著高于50∶10、20∶40、10∶50 組（P<0.01）。C∶R 為 30∶70 時，E∶A 為55∶15、 40∶30 組 GP72h、 DMD、 OMD、 NH3-N、TVFA 的 AE 和 MFAEI 極顯著高于 25∶45、10∶60 組（P<0.01），且25∶45組NH3-N、TVFA的AE極顯著高于 10∶60 組（P<0.01）。C∶R 為 20∶80 時，E∶A 為20∶60 組 GP72h的 AE 極顯著高于 65∶15、50∶30 組（P<0.01）；20∶60、35∶45組OMD的AE極顯著高于65∶15、50∶30 組（P<0.01）；20∶60 組 DMD、NH3-N、TVFA 的 AE、MFAEI 極顯著高于其他組（P<0.01），35∶45 組 NH3-N 的 AE 極顯著高于 65∶15 組（P<0.01），35∶45 組DMD、TVFA 的AE、MFAEI極顯著高于65∶15、50∶30組（P<0.01）。

3 討 論

榆樹葉a為正值，即產氣不滯后。精料、苜蓿a為負值，精料比苜蓿產氣滯后時間更長。因為本研究中，玉米占85%，較大麥（Hordeum vulgareL.）有更長產氣滯后時間[16]。精料b 和c 較高，榆樹葉GP72h和（a+b）最高，表明3種飼料中，榆樹葉產氣性能最佳。

本試驗中，飼糧AE 效果較優的6 個組合依次為：30∶55∶15>40∶40∶20>50∶20∶30>20∶20∶60>60∶10∶30>80∶20∶0，即 C∶R 依 次 為 30∶70、 40∶60、50∶50、20∶80、60∶40及無苜蓿組。低精料配比高粗料（C∶R 為30∶70）時，高比例榆樹葉（55、40）及低比例苜蓿（15、30）組合效果最佳；隨精料增加（C∶R為40∶60、50∶50、60∶40），AE效果降低，需配比榆樹葉比例亦降低（40、20、10），即精料越高，越不利于榆樹葉利用。精粗比為30∶70時，不同飼料間協同互作效果最強，飼料間AE最大。說明在一定程度上榆樹葉可替代精料使用量。由此可知，不加苜蓿組AE最小，苜蓿、榆樹葉、精料3 者配比組合后AE 效果顯著優于榆樹葉、精料組合。樹葉與精料配比，GP的AE為正[17]。苜蓿配比小麥秸（Triticum aestivumL.），產氣參數呈正AE[18]。將慢速發酵纖維（純纖維素、奶薊草）速發酵纖維（無籽番茄（Solanum lycopersicum）、柑橘渣、果膠）按 75∶25 或 25∶75 配比后，GP 顯著增加[19]。前人及本試驗結果均表明，低質粗飼料與優質牧草及精料科學搭配后，可產生正AE。

GP 可有效預測飼料在瘤胃中消化率[20]。將單一及配比飼料體外培養，通過GP 等指標可確定混合飼料AE。皇竹草∶象草為75∶25 時，山羊瘤胃DM、CP 及 NDF 降解率及其正 AE 最高[21]。郝小燕等、成啟明等研究表明，苜蓿∶青貯玉米∶玉米纖維飼料為40∶39∶21，而玉米秸∶檸條為70∶30 時，AE效果最佳[22-23]。瘤胃pH為6.0～7.0，可充分反應瘤胃內發酵情況和環境變化。本研究中，60∶10∶30、 50∶20∶30、 50∶10∶40、 40∶40∶20、 40∶30∶30、30∶55∶15、30∶40∶30、20∶20∶60、80∶20∶0、60∶40∶0 組pH 顯著低于同精粗比的其他組。因為這10個組合產氣和發酵參數較高，TVFA較高。VFA速度快于瘤胃對其的吸收速度，降低瘤胃內pH。

GP 與瘤胃微生物發酵活性、飼料消化率呈正相關[10]。DMD 和OMD 是衡量飼料營養價值的重要指標。本研究中，GP、DMD 和OMD 變化趨勢一致。苜蓿有效降解率較高，碳氮比更適合瘤胃微生物繁殖[24]。苜蓿配比低質牧草后GP、DM 采食量、NDF 消化率呈正AE[25]。NH3-N 濃度可充分反映飼料在瘤胃中蛋白質分解、氮代謝、微生物蛋白質合成情況。本研究中，25 種飼糧組合NH3-N濃度為 10.27～23.41 mg·dL-1，處于正常范圍。30∶55∶15、40∶40∶20、50∶20∶30、20∶20∶60、60∶10∶30、80∶20∶0組NH3-N顯著高于其他組，原因是這6 個組合中精料、榆樹葉、苜蓿之間發生協同作用，增強瘤胃內碳、氮同步釋放，促進微生物蛋白質合成效率。飼糧中可消化碳水化合物發酵產生VFA，GP 與TVFA 產量呈正相關，與乙酸亦呈正相關。乙酸/丙酸反映瘤胃發酵類型。本研究中，25 種飼糧組合乙酸/丙酸均大于3，屬于乙酸發酵型，有助于反芻動物乳脂率提高。

單項組合效應指數（SFAEI）僅通過某一指標評價飼糧AE，缺乏代表性和準確性。盧德勛根據體外產氣法在不同時間點測定各項指標，提出“綜合組合效應指數（MFAEI）”概念[26]。韓肖敏等、李妍等研究發現稻草∶玉米秸∶玉米秸青貯∶精料為6.4∶9.6∶24∶60，谷草∶玉米秸為40∶60，谷草∶玉米秸∶玉米秸青貯為8∶12∶80時，MFAEI較佳[27-28]。不同種類粗飼料或精、粗飼料配比組合后，由于營養素互補，日糧整體發酵水平和發酵性能更高。本研究發現，精料∶榆樹葉∶苜蓿最佳MFAEI 組依次 為 30∶55∶15、 40∶40∶20、 50∶20∶30、 20∶20∶60、60∶10∶30、80∶20∶0 組；尤以精粗比30∶70 時MFAEI 最佳，30∶55∶15 組為 501.87%，30∶40∶30組為441.81%，40∶40∶20 組為439.00%。推測原因可能為原料中鞣酸、發酵基質間相互作用，改善底物降解特性，提高飼料消化率。