種子分泌物中酚酸對(duì)大豆疫霉菌生長發(fā)育及游動(dòng)孢子趨化性的影響

文景芝，于 涵，張卓群，畢湘琪，劉海旭，楊治月，宋光梅，張湘笛，唐 宇，陳宇飛

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

由大豆疫霉（Phytophthora sojaeKaufmann &Gerdemann）引發(fā)的大豆疫霉根腐病（Phytophthora root rot）是大豆生產(chǎn)毀滅性病害，每年導(dǎo)致全球損失10億～20億美元[1]。大豆疫霉游動(dòng)孢子識(shí)別寄主大豆（Glycine maxL.）是大豆疫霉與寄主大豆相互作用第一步，在土壤水分飽和條件下，由大豆疫霉菌絲頂端產(chǎn)生的游動(dòng)孢子囊通過原生質(zhì)體割裂形成并釋放大量有兩根鞭毛、無細(xì)胞壁、單核、單細(xì)胞的游動(dòng)孢子[2]。游動(dòng)孢子感知寄主大豆釋放的化學(xué)信號(hào)分子，在鞭毛推動(dòng)下向寄主大豆游動(dòng)，進(jìn)而成囊、萌發(fā)，通過芽管穿透寄主表皮侵入并實(shí)現(xiàn)侵染[3]。

種子分泌物是種子際重要組成，影響種子周圍土壤微生物（尤其是病原微生物）生長發(fā)育[4]。種子分泌物中存在大量抑菌物質(zhì)，保護(hù)植物不被病原物侵染。如羽扇豆（Lupinus albus）種子分泌物中含大量幾丁質(zhì)酶，可有效抑制病原真菌生長[5]。寄主大豆根系和種子分泌物中存在大豆異黃酮，該物質(zhì)可作為特異性引誘劑吸引大豆疫霉游動(dòng)孢子[6-7]，此外，種子分泌物中氨基酸和可溶性糖作為非特異性引誘劑吸引大豆疫霉游動(dòng)孢子[8]。玉米（Zea maysL.）與大豆合理輪作有效控制大豆疫霉根腐病，因玉米種子分泌物排斥大豆疫霉游動(dòng)孢子[9-10]。與大豆同屬豆科非寄主植物菜豆（Phaseo?lus vulgarisL.）根系（種子）分泌物中含有與大豆種子分泌物接近等量的異黃酮[11]，但菜豆種子分泌物不吸引大豆疫霉游動(dòng)孢子，自然條件下也不被大豆疫霉侵染[10]，但在人工接種條件下，菜豆被大豆疫霉侵染[12]，說明種子分泌物中存在對(duì)游動(dòng)孢子有排斥作用的物質(zhì)，保護(hù)菜豆不被大豆疫霉侵染。

酚酸類物質(zhì)是土壤中重要一類化感物質(zhì)，主要來自植物殘?bào)w分解和根系（種子）分泌[13,4]。作物根系釋放的酚酸可在土壤中累積，產(chǎn)生自毒作用抑制作物生長，造成作物連作障礙[14]。酚酸類物質(zhì)可有效抑制土壤微生物（尤其是病原微生物）生長，如酚酸可有效抑制病原真菌如西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.niveum）以及黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf. sp.cucumerinum）生長發(fā)育[15-16]。白羽祥等報(bào)道表明，酚酸抑制病原卵菌煙草黑脛病菌（Phytophora parasiticavar.nicotiana）生長發(fā)育[17]，但是否對(duì)同為卵菌的大豆疫霉產(chǎn)生抑制作用目前尚不可知。

本研究在前期明確不同品種種子分泌物對(duì)大豆疫霉趨化作用基礎(chǔ)上，對(duì)不同品種種子分泌物中酚酸組分開展色譜分析，測定酚酸種類和濃度，明確外源酚酸對(duì)大豆疫霉菌絲生長、游動(dòng)孢子囊形成、游動(dòng)孢子趨化性和成囊影響，旨在闡明種子分泌物中酚酸如何調(diào)控大豆疫霉發(fā)育和侵染行為，為設(shè)計(jì)高效卵菌藥劑，實(shí)現(xiàn)大豆疫霉根際行為預(yù)測和調(diào)節(jié)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

大豆疫霉菌Eps597-3 為增強(qiáng)型綠色熒光蛋白標(biāo)記菌株，其致病型為1a,3c,7，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試植物

寄主植物：大豆（Glycine maxL.）感病品種Sloan：不含任何已知抗大豆疫霉根腐病基因；大豆抗病品種Williams82：含抗疫霉根腐病基因Rps1k，對(duì)供試菌株Eps597-3 表現(xiàn)抗病。以上兩種材料均由Dr.Sung M.Lim（University of Arkansas）惠贈(zèng)。

非寄主植物：菜豆（Phaseolus vulgarisL.）品種紫花油豆；玉米（Zea maysL.）品種綏玉23，自然條件下均不被供試菌株Eps597-3 侵染，購于黑龍江北大荒種業(yè)集團(tuán)有限公司。

1.1.3 供試試劑

色譜純級(jí)香草酸（Vanillin acid）、阿魏酸（Feru?lic acid）、丁香酸（Syringic acid）、對(duì)香豆酸（p-Coumaric acid）和對(duì)羥基苯甲酸（p-Hydroxybenzoic acid）均購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，4 ℃冰箱保存；色譜級(jí)甲醇購于天津富宇精細(xì)化工有限公司，實(shí)驗(yàn)室藥品柜內(nèi)避光保存。

1.2 方法

1.2.1 種子分泌物收集

選取均勻、飽滿健康供試種子10 g，75%酒精浸泡消毒1 min，無菌蒸餾水洗滌，放入含5 mL無菌蒸餾水培養(yǎng)皿（d=10 cm）中，黑暗條件下室溫（25 ℃）放置，24 h后種子吸水膨脹釋放種子分泌物，補(bǔ)充無菌蒸餾水至10 mL，48 h時(shí)將種子移出，使種子分泌物濃度為1 g 種子鮮重對(duì)應(yīng)1 mL 無菌蒸餾水，將混合液用細(xì)菌濾器（孔徑為0.22 μm）過濾除菌，濾液移入無菌培養(yǎng)皿（d=10 cm）內(nèi)并置于-80 ℃冰箱冷凍，然后在Alpha 1-4 中型凍干機(jī)（CHRIST，德國）內(nèi)冷凍干燥備用。每個(gè)品種重復(fù)收集3次。

1.2.2 種子分泌物中5種酚酸測定

分別取經(jīng)冷凍干燥種子分泌物，80%甲醇溶解并定容至1 mL，在超聲波振蕩儀（舒美KQ300-ES0，中國）上充分震蕩 30 min，0.22 μm 濾膜過濾，濾液移至液相進(jìn)樣瓶中，在島津LC-10A高效液相色譜儀（Shimadzu Corporation，京都，日本）上作HPLC分析。

以色譜純級(jí)5 種酚酸（阿魏酸、丁香酸、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)香豆酸和香草酸）作為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)4種種子分泌物樣品中酚酸含量作HPLC分析。標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度分別為0、0.4、0.6、0.8和1.0 mg·L-1。通過標(biāo)準(zhǔn)品峰面積及濃度得到標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測樣濃度。色譜條件：進(jìn)樣量5 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器，流動(dòng)相A泵為甲醇（色譜純）；B泵為水（超純水），A、B泵流速比為1∶3，流速之和為1.0 mL·min-1，柱溫25 ℃，DAD檢測波長280 nm，測定時(shí)間為30 min，采用外標(biāo)法定量。

1.2.3 外源酚酸對(duì)大豆疫霉菌絲生長的影響

參照文景芝等方法[18]：將定量CA 培養(yǎng)基冷卻至50 ℃，將5 mL 分裝至直徑6 cm 培養(yǎng)皿內(nèi)，加入酚酸母液使培養(yǎng)基中酚酸濃度為0.01、0.1 和1 μg·mL-1，以等量無菌蒸餾水代替酚酸溶液為空白對(duì)照。平板凝固后接種活化3～4 d的Eps597-3 菌餅（d=5 mm），25 ℃恒溫培養(yǎng)，于第4 天測量菌落直徑。每個(gè)藥劑濃度3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 外源酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子囊形成的影響

參照宋光梅等方法[12]：直徑5 mm 打孔器從普通CA平板上打取活化培養(yǎng)4 d大豆疫霉菌碟10塊，放在裝有10 mL 不同濃度（0.01、0.1 和1 μg·mL-1）酚酸溶液培養(yǎng)皿內(nèi)，以等量無菌蒸餾水為空白對(duì)照。25 ℃恒溫避光條件下培養(yǎng)，2 d 后于100 倍倒置光學(xué)顯微鏡下觀察，每個(gè)菌碟至少觀察10 個(gè)視野，計(jì)數(shù)不同處理菌碟上產(chǎn)生的孢子囊數(shù)量，計(jì)算總數(shù)和孢子囊形成抑制率，孢子囊形成抑制率（%）=（對(duì)照孢子囊總數(shù)-處理孢子囊總數(shù)）/對(duì)照孢子囊總數(shù)×100。每個(gè)濃度重復(fù)測定3次。

1.2.5 外源酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子趨化性的影響

趨化性試驗(yàn)參照文景芝等方法[18]，在潔凈載玻片上相距3 cm 用101膠粘兩條玻璃片（或塑料片），其上蓋玻片，使其形成1 個(gè)深度為3 mm 空間。用移液槍向空間內(nèi)加入新鮮大豆疫霉游動(dòng)孢子懸浮液。依據(jù)測得5 種酚酸含量，配制梯度濃度（0.01、0.1 和1 μg·mL-1）溶液。取2 μL充滿酚酸溶液毛細(xì)管插入裝置左端，右端插入2 μL裝有無菌蒸餾水毛細(xì)管作對(duì)照。記錄15 min時(shí)兩側(cè)毛細(xì)管中游動(dòng)孢子數(shù)量，比較游動(dòng)孢子對(duì)5 種外源單一酚酸趨化性。試驗(yàn)室溫（25 ℃），每個(gè)濃度重復(fù)測定4次。

1.2.6 外源酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子成囊的影響

成囊試驗(yàn)參照文景芝等方法[19]，在雙凹玻片兩個(gè)凹槽內(nèi)分別滴加200 μL 孢子懸浮液，然后在一個(gè)凹槽內(nèi)加酚酸溶液，使其最終濃度分別為0.01、0.1 和1 μg·mL-1，另一個(gè)凹槽內(nèi)加等量無菌蒸餾水，分別記錄0.5 h 時(shí)游動(dòng)和成囊游動(dòng)孢子數(shù)量，計(jì)算成囊促進(jìn)率，成囊促進(jìn)率（%）=（處理成囊率-對(duì)照成囊率）/對(duì)照成囊率×100。每個(gè)濃度重復(fù)測定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子分泌物中酚酸種類及含量

分別對(duì)寄主和非寄主種子分泌物中5種酚酸作HPLC 測定，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。各標(biāo)準(zhǔn)曲線R2值均高于0.99，可靠性強(qiáng)，通過計(jì)算得到各種子分泌物中酚酸濃度，結(jié)果如表1所示。

寄主和非寄主種子分泌物中酚酸種類和含量存在差異，香草酸僅在菜豆中被檢測到，含量為6.53 μg·L-1；香豆酸僅存在于豆科植物中，含量為大豆感病品種>菜豆>大豆抗病品種，且三者之間含量差異顯著；對(duì)羥基苯甲酸僅存在于大豆感病品種中，含量為28.40 μg·L-1；丁香酸未在大豆抗病品種中檢測到，在其他3個(gè)品種中含量差異為菜豆>玉米≥大豆感病品種，其中菜豆中含量顯著高于其他兩個(gè)品種；阿魏酸在4個(gè)品種中均檢測到，含量為玉米≥菜豆≥大豆抗病品種≥大豆感病品種，非寄主玉米中含量顯著高于大豆抗、感品種。

4種種子分泌物中，菜豆中酚酸總含量顯著高于其他3個(gè)品種；大豆感病品種次之，且顯著高于大豆抗病品種；玉米中酚酸總含量高于大豆抗病品種，但差異不顯著。

圖1 5種酚酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程Fig.1 Standard curves and regression equations of five kinds of phenolic acids

表1 種子分泌物中酚酸種類及含量Table 1 Kinds and contents of phenolic acids in seed exudates (μg·L-1)

2.2 酚酸對(duì)菌絲生長的影響

酚酸對(duì)大豆疫霉菌絲生長影響如圖2所示。濃度為0.01 μg·mL-1時(shí)，酚酸處理組菌落直徑均顯著高于對(duì)照組（3.90 cm），以對(duì)羥基苯甲酸促進(jìn)作用最強(qiáng)，菌落直徑為5.08 cm，其他酚酸間無顯著差異；當(dāng)濃度為0.1 μg·mL-1時(shí)，除對(duì)香豆酸處理組菌落直徑（4.27 cm）顯著高于對(duì)照組外，其他4種酚酸處理組菌落直徑均與對(duì)照組無顯著差異，以對(duì)羥基苯甲酸處理組菌落直徑最小為3.85 cm；當(dāng)濃度為1 μg·mL-1時(shí)，除香草酸菌落直徑（3.53 cm）顯著低于對(duì)照組外，其他4種酚酸菌落直徑與對(duì)照組間無顯著差異。此時(shí)，對(duì)香豆酸菌落直徑（4.13 cm）顯著高于其他4種酚酸，而其他4種酚酸間無顯著差異。

以上結(jié)果表明，酚酸對(duì)大豆疫霉菌絲生長促進(jìn)程度與濃度呈負(fù)相關(guān)。低濃度酚酸促進(jìn)大豆疫霉菌絲生長，隨濃度增加，促進(jìn)程度逐漸降低，大部分酚酸隨濃度升高甚至轉(zhuǎn)為抑制菌絲生長，但抑制程度不明顯。

圖2 酚酸對(duì)大豆疫霉菌絲生長的影響Fig.2 Effect of phenolic acid on mycelial growth of Phytophthora sojae

2.3 酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子囊形成的影響

5種酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子囊形成的影響如圖3 所示。在0.01～1 μg·mL-1內(nèi)，5 種酚酸均表現(xiàn)為抑制作用（除丁香酸0.01 μg·mL-1表現(xiàn)為促進(jìn)作用外）。酚酸處理組游動(dòng)孢子囊數(shù)目均與對(duì)照組存在顯著差異，抑制率為8.01%～73.17%，抑制作用隨濃度升高而增加。當(dāng)濃度為0.01 μg·mL-1時(shí)，除丁香酸外其他4 種酚酸均顯著抑制游動(dòng)孢子囊形成，其中，香草酸和對(duì)羥基苯甲酸抑制率最高，均為33.13%，阿魏酸抑制率最低為8.01%，丁香酸卻顯著促進(jìn)游動(dòng)孢子囊形成，促進(jìn)率為54.07%；當(dāng)濃度升至0.1 μg·mL-1時(shí)，5種酚酸均抑制游動(dòng)孢子囊形成，除丁香酸處理游動(dòng)孢子囊數(shù)目與對(duì)照無顯著差異外，其他4種酚酸均顯著抑制游動(dòng)孢子囊形成，其中對(duì)羥基苯甲酸抑制率最高為40.41%，丁香酸抑制率最低為15.75%；濃度升至1 μg·mL-1時(shí)，5 種酚酸均顯著抑制游動(dòng)孢子囊形成，其中對(duì)香豆酸抑制率最高為73.17%，丁香酸抑制率最低為51.22%。

2.4 酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子趨化性的影響

5 種酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子吸引程度如圖4所示，在0.01 μg·mL-1時(shí)，游動(dòng)孢子對(duì)5 種酚酸均表現(xiàn)出趨化反應(yīng)，尤以對(duì)丁香酸趨化性最強(qiáng)，趨化性促進(jìn)率為115.10%，阿魏酸次之，趨化性促進(jìn)率為92.48%，對(duì)香豆酸和香草酸趨化性促進(jìn)率分別為79.68%和72.46%，對(duì)羥基苯甲酸趨化性促進(jìn)率為60.86%；濃度升至0.1 μg·mL-1時(shí)，游動(dòng)孢子對(duì)5種酚酸均表現(xiàn)趨避反應(yīng)，尤以對(duì)對(duì)羥基苯甲酸趨避反應(yīng)最為強(qiáng)烈，趨化性抑制率為62.70%，顯著高于其他4種酚酸，對(duì)香豆酸趨避反應(yīng)次之，趨化性抑制率為51.70%，阿魏酸和丁香酸趨化性抑制率分別為44.56%和41.96%，而對(duì)香草酸趨避反應(yīng)最弱，趨化性抑制率為34.86%；濃度增至1 μg·mL-1時(shí)，游動(dòng)孢子對(duì)5種酚酸趨避反應(yīng)更為強(qiáng)烈，尤以對(duì)香豆酸和對(duì)羥基苯甲酸趨避反應(yīng)最強(qiáng)，趨化性抑制率分別為83.40%和82.31%，高于其他3 種酚酸，丁香酸和阿魏酸趨避反應(yīng)次之，趨化性抑制率分別為75.14%和72.95%，香草酸趨避反應(yīng)最弱，趨化性抑制率為60.93%。

5種酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子趨化性影響雖有細(xì)微差異，但表現(xiàn)出一致趨勢(shì)，即酚酸濃度在0.1 μg·mL-1以下時(shí)，游動(dòng)孢子表現(xiàn)出趨化反應(yīng)；而當(dāng)濃度≥0.1 μg·mL-1時(shí)，游動(dòng)孢子開始表現(xiàn)出趨避反應(yīng)，且濃度越高，趨避反應(yīng)越強(qiáng)烈。

圖3 酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子囊形成的影響Fig.3 Effects of phenolic acids on sporangia formation of Phytophthora sojae

圖4 酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子趨化性的影響Fig.4 Effects of phenolic acids on chemotaxis of zoospores of Phytophthora sojae

2.5 酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子成囊的影響

5 種酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子成囊影響如圖5所示。

由圖5可知，當(dāng)處理0.5 h時(shí)，5種酚酸對(duì)游動(dòng)孢子成囊影響表現(xiàn)為濃度越高，促進(jìn)作用越強(qiáng)。當(dāng)濃度為0.01 μg·mL-1時(shí)，僅對(duì)香豆酸表現(xiàn)為促進(jìn)游動(dòng)孢子成囊，促進(jìn)率為15%，其他4種酚酸均表現(xiàn)為抑制游動(dòng)孢子成囊，其中以丁香酸抑制作用最強(qiáng)，抑制率為6.64%，香草酸抑制率為2.76%，阿魏酸和對(duì)羥基苯甲酸抑制率分別為1.87%和0.42%，4種酚酸抑制率間無顯著差異；當(dāng)濃度升至0.1 μg·mL-1時(shí)，5種酚酸均表現(xiàn)為促進(jìn)游動(dòng)孢子成囊，以對(duì)香豆酸促進(jìn)作用最強(qiáng)，促進(jìn)率為26.29%，顯著高于丁香酸和對(duì)羥基苯甲酸促進(jìn)率15.7%和10.72%，阿魏酸促進(jìn)率為2.48%，香草酸促進(jìn)率僅為0.38%；濃度升至1 μg·mL-1時(shí)，除對(duì)香豆酸外，其他4種酚酸促進(jìn)率均顯著提升，以阿魏酸促進(jìn)作用最強(qiáng)，促進(jìn)率32.68%，對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸和對(duì)香豆酸促進(jìn)率依次為27.87%、26.85%和25.29%，香草酸促進(jìn)率為15.93%。5 種酚酸中以1 μg·mL-1阿魏酸促進(jìn)作用最強(qiáng)，0.01 μg·mL-1丁香酸中游動(dòng)孢子最活躍。

圖5 酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子成囊的影響Fig.5 Effects of phenolic acids on encystment of zoospores of Phytophthora sojae

3 討 論

種子萌發(fā)吸水膨脹并釋放氨基酸、糖類和酚酸類等多種化學(xué)物質(zhì)，不同植物和同種植物不同品種種子（根系）分泌物組分均存在差異[8,20]。本研究也發(fā)現(xiàn)，大豆疫霉寄主和非寄主種子分泌物中酚酸種類差異較大，菜豆和大豆感病品種種子分泌物中酚酸種類最多為4種，而大豆抗病品種和玉米種子分泌物中僅檢測出2種酚酸，阿魏酸是4個(gè)品種中唯一共有酚酸。在大豆感病品種中檢測到對(duì)羥基苯甲酸，在菜豆中僅檢測到香草酸。研究表明，大豆根系分泌物中僅存在對(duì)羥基苯甲酸和香草酸[21]，與本文結(jié)果不同，可能與品種及采樣生育期有關(guān)。植物中酚酸生物合成涉及苯丙烷代謝途徑，該途徑中許多次生代謝產(chǎn)物如植保素、木質(zhì)素和酚類物質(zhì)等與抗病性相關(guān)，對(duì)香豆酸是豆科植物苯丙烷代謝途徑中黃酮類物質(zhì)合成前體[22-23]，本研究在豆科植物種子分泌物中均檢測到對(duì)香豆酸存在，在大豆感病品種中含量高于大豆抗病品種。研究表明根系分泌物中異黃酮含量為大豆感病品種>大豆抗病品種>菜豆[11]，但本研究中菜豆種子分泌物中對(duì)香豆酸含量卻高于大豆抗病品種，這種差異可能是因品種不同所致。大豆抗、感品種種子分泌物中酚酸總含量差異顯著，酚酸種類差異顯著，共有酚酸含量差異顯著，但種子分泌物中酚酸種類和含量是否與抗性基因（Rps1k）相關(guān)尚不清楚。

根系分泌物中酚酸含量差異對(duì)土壤病原物造成差異性影響[14,24-26]，如煙草根系分泌物中酚酸對(duì)煙草黑脛病菌（Phytophora parasiticavar.nicotiana）菌絲生長及游動(dòng)孢子囊形成影響與濃度有關(guān)，低濃度促進(jìn)而高濃度抑制，不同酚酸拐點(diǎn)存在差異，對(duì)羥基苯甲酸和丁香酸拐點(diǎn)濃度為100 μg·mL-1，阿魏酸和香草酸拐點(diǎn)濃度為10 μg·mL-1[17]。本研究發(fā)現(xiàn)5種酚酸對(duì)大豆疫霉菌絲生長和游動(dòng)孢子囊形成影響趨勢(shì)一致，低濃度（0.01 μg?mL-1）酚酸均促進(jìn)菌絲生長，隨濃度升高，促進(jìn)作用減弱，直至呈不顯著抑制趨勢(shì)，推測更高濃度酚酸將抑制大豆疫霉菌絲生長，但具體拐點(diǎn)濃度需深入研究。本研究發(fā)現(xiàn)除丁香酸在低濃度（0.01 μg·mL-1）時(shí)表現(xiàn)為促進(jìn)游動(dòng)孢子囊形成外，各酚酸在濃度0.01～1 μg·mL-1內(nèi)對(duì)游動(dòng)孢子囊形成抑制程度均與濃度呈正相關(guān)。宋光梅等研究表明，大豆抗、感品種和非寄主菜豆種子分泌物對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子囊形成均存在抑制作用，菜豆種子分泌物抑制作用最強(qiáng)[12]，與本文研究結(jié)果一致，由此可推斷，種子分泌物中酚酸可能是影響大豆疫霉游動(dòng)孢子囊形成關(guān)鍵物質(zhì)之一。

酚酸對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子趨化性影響表現(xiàn)為低濃度（<0.1 μg·mL-1）時(shí)吸引，而高濃度（>0.1 μg·mL-1）時(shí)排斥。本試驗(yàn)中，玉米種子分泌物中酚酸總濃度為 0.03745 μg·mL-1，低于0.1 μg·mL-1，理論上應(yīng)吸引游動(dòng)孢子，但玉米種子分泌物對(duì)游動(dòng)孢子排斥作用顯著[10]，由此推斷，玉米種子分泌物中應(yīng)還存在其他物質(zhì)排斥游動(dòng)孢子，且排斥作用遠(yuǎn)大于低濃度酚酸吸引作用。本試驗(yàn)中，菜豆種子分泌物中酚酸總濃度為0.12 μg·mL-1，高于0.1 μg·mL-1，理論上應(yīng)排斥游動(dòng)孢子，但菜豆種子分泌物對(duì)大豆疫霉游動(dòng)孢子無明顯吸引或排斥作用[10]，這可能與菜豆種子分泌物中存在對(duì)游動(dòng)孢子有特異性吸引作用的異黃酮有關(guān)[27]，異黃酮吸引作用與酚酸排斥作用相互抵消。本試驗(yàn)中大豆感病品種酚酸濃度為0.06364 μg·mL-1，高于大豆抗病品種酚酸濃度0.01027 μg·mL-1，但大豆感病品種種子分泌物對(duì)游動(dòng)孢子吸引程度顯著高于抗病品種[18]，與抗病品種種子分泌物中存在其他排斥游動(dòng)孢子的物質(zhì)如大豆抗毒素有關(guān)。

酚酸濃度在0.01～1 μg·mL-1內(nèi)影響游動(dòng)孢子成囊，且成囊率與濃度呈正相關(guān)。本研究中對(duì)香豆酸始終促進(jìn)游動(dòng)孢子成囊，對(duì)香豆酸是黃酮類物質(zhì)合成前體，因此推斷種子分泌物中對(duì)香豆酸可能也是游動(dòng)孢子識(shí)別寄主關(guān)鍵物質(zhì)之一；玉米種子分泌物刺激游動(dòng)孢子成囊[10]，但在玉米中檢測到兩種酚酸在各自原位濃度下并未有效刺激游動(dòng)孢子成囊。張賀等研究表明，玉米根組織中苯并噻唑類物質(zhì)苯并噻唑（BZO）和苯并惡嗪類物質(zhì)門布（MBOA）可有效促進(jìn)游動(dòng)孢子成囊[9]，推測玉米種子分泌物中也存在這兩類物質(zhì)導(dǎo)致游動(dòng)孢子成囊。前期研究發(fā)現(xiàn)，菜豆種子分泌物處理2 h后，部分游動(dòng)孢子發(fā)生裂解[12]，本研究中發(fā)現(xiàn)游動(dòng)孢子裂解與菜豆種子分泌物中高濃度酚酸（≥0.1 μg·mL-1）有關(guān)，但裂解原因尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。當(dāng)酚酸濃度高于0.1 μg·mL-1時(shí)，對(duì)大豆疫霉生長發(fā)育造成負(fù)面影響且游動(dòng)孢子表現(xiàn)出趨避反應(yīng)，對(duì)植物產(chǎn)生保護(hù)作用，但過高濃度酚酸對(duì)作物產(chǎn)生毒害作用[28]，因此，生產(chǎn)中可選擇適宜濃度酚酸用于設(shè)計(jì)防治大豆疫霉根腐病種衣劑或保護(hù)性農(nóng)藥。