大豆再生相關性狀QTL定位

滕衛麗，鄭立娜，張 琦，趙 雪，韓英鵬，李文濱

（東北農業大學大豆研究所，大豆生物學教育部重點實驗室，農業農村部東北大豆生物學與遺傳育種重點實驗室，哈爾濱150030）

大豆（Glycine maxL.）起源于中國，種植歷史悠久，其種子富含植物蛋白質和油脂，是世界上重要糧油兼備作物[1]。近年來，轉基因大豆種植面積逐年增加，是目前為止全球種植面積最大[2-3]、商業化程度最高的轉基因農作物[4]，主要栽培于美國、巴西、阿根廷、加拿大和印度[5]。轉基因大豆種植提高社會經濟效益，加快轉基因育種步伐[6]。我國大豆產業存在單產偏低、種植成本偏高等現象，現已成為世界最大大豆消費國和進口國[7]。加快國內轉基因技術研究對于改變大豆產業被動局面具有重要意義。

植物轉基因技術是將外源基因通過生物技術導入受體植物基因組中并穩定表達，產生抗病蟲、抗除草劑、抗逆、高產、營養品質改良等滿足人類需求的技術[8]。轉基因技術相比于傳統育種技術，打破物種間生殖隔離，促進不同物種間遺傳物質交流，降低不良突變效率[9]。大豆相較于玉米和水稻遺傳轉化效率較低[10]。轉基因技術關鍵在于外源基因穩定高效導入受體細胞和轉化細胞再生出完整植株。建立高效穩定大豆再生體系是開展大豆遺傳轉化的前提[11]。大豆基因型較大程度上決定大豆遺傳轉化效率，不同基因型之間農桿菌易感性和組織培養再生率存在顯著差異[12]，提高大豆遺傳轉化效率和再生效率關鍵在于篩選再生能力較強基因型。

王立平等綜合國內外學者研究發現，器官發生再生系統和胚狀體再生系統等主要遺傳轉化體系轉化效率對大豆基因型具有較高依賴性[3]。翟銳等以17 個大豆品種作為易感基因型和高再生基因型篩選對象，結果表明TL-1 極顯著優于其他基因型，Williams 82、HC-6、HC-3次之[13]。李文霞等以11 個大豆品種為材料研究基因型對農桿菌敏感度，結果表明，黑農35是最易感大豆基因型，其次為綏農14和合豐35，易感性最差品種是黑農44[14]。李思楠等以再生能力較好的東農50 在2，4-D 濃度為4 mg·L-1時再生率最高[15]。張偉偉等將抗逆轉錄因子基因HhERF轉入再生能力強百脈根中分析抗逆能力，篩選獲得抗性百脈根植株96 株，轉化率達到24%[16]。

本研究利用高再生率大豆品種合豐25 和低再生率大豆品系L-28及其衍生重組自交系群體（RIL）100個家系作為試驗材料，評價其再生率并作QTL定位分析，為探索大豆再生規律、提高大豆遺傳轉化效率、加快培育轉基因大豆新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究選用當地品種合豐25和L-28衍生重組自交系群體100個家系。

1.2 再生試驗方法

1.2.1 種子滅菌及萌發

挑選顆粒完整且飽滿、健康無病無斑、成熟干燥種子單層平鋪于玻璃培養皿中，75%乙醇擦拭種皮表面，再將培養皿置于干燥器中（通風櫥中完成），將1 個裝有96 mL 次氯酸鈉錐形瓶置于靠近干燥器內壁位置，加蓋但保留縫隙，向錐形瓶中加入6 mL 濃鹽酸，迅速蓋嚴干燥器，滅菌16 h后，打開干燥器，蓋好培養皿。

將滅菌后大豆種子在超凈臺中打開，風干30 min。取出接種到GM 萌發培養基，萌發5～6 d，直至種子發芽變綠。

1.2.2 外植體制備

將發芽大豆去掉種皮，切除多余下胚軸部分，保留全部子葉和2～3 mm下胚軸，在兩片子葉沿中線縱向切開，且平分下胚軸，去子葉節點部位殘留大芽，刮掉側芽（見圖1）。

圖1 外植體制備Fig.1 Preparation of explants

1.2.3 叢生芽誘導

將子葉節接種在SSIM-恢復固體培養基中，經（25±1）℃，16 h/8 h培養13～15 d，誘導叢生芽，統計叢生芽誘導率。

1.2.4 伸長芽誘導

切除外植體子葉，刮掉不定芽上多余培養基，并切除叢生芽上誘導出的莖葉，僅留下誘導的一簇小芽，插入SEM伸長培養基中。

每隔14 d 繼代1 次，每次繼代均制備新的傷口，以便叢生芽更好吸收培養基中養分，接種至伸長培養基28 d后統計叢生芽伸長率。

1.2.5 生根與移栽

伸長出枝條長至3～5 cm 時，切下伸長出枝條，轉移至RM生根培養基中，誘導生根。長出2～3條主根后，去除培養基，在三角瓶中加入自來水（水面在根上方）煉苗2～3 d，移栽到草炭土與蛭石為1∶1花盆。

1.2.6 大豆子葉節法再生體系過程

大豆子葉節法再生體系過程如圖2所示。

1.2.7 培養基組成

外植體在組織培養各階段所需培養基成分如表1所示。

圖2 子葉節法評價再生率流程Fig.2 Flow chart of cotyledon section method for regeneration in soybean

表1 培養基組成Table 1 Composition of the medium

1.2.8 再生率計算方法

每個試驗品種每個處理40個外植體，3次重復。

不定芽誘導率（%）=出芽外植體數/接種外植體數×100；

不定芽伸長率（%）=芽長大于2 cm 外植體數/接種外植體數×100；

不定芽生根率（%）=生根外植體數/接種外植體數×100；

不定芽成苗率（%）=成苗外植體數/接種外植體數×100。

1.3 表型數據分析與處理

采用SPSS 19.0 數據處理系統統計分析大豆RIL群體再生評價指標。

1.4 QTL分析

利用IciMapping 4.0 軟件中完備區間作圖法（ICIM）分析大豆RIL群體4個再生性狀QTL定位。

2 結果與分析

2.1 大豆RIL群體再生率評價

2.1.1 RIL群體再生性狀方差分析

對高再生率大豆品種合豐25 與低再生率大豆品系L-28雜交衍生重組自交系群體100份家系4個再生性狀作方差分析（見表2）。結果表明，叢生芽誘導率、伸長率、生根率和成苗率P值均小于0.01，即4個再生性狀均達極顯著，說明該性狀在RIL群體不同家系間存在顯著差異，不同大豆家系間再生率差異較大。

2.1.2 RIL群體再生性狀相關性分析

分析大豆RIL 群體4 個再生性狀相關性（見表3）。結果表明，叢生芽誘導率與伸長率、生根率和成苗率呈極顯著正相關，伸長率與生根率和成苗率呈極顯著正相關，生根率與成苗率呈極顯著正相關。

表2 大豆RIL群體4個再生性狀方差分析Table 2 Variance analysis of four traits correlated with regeneration of RIL population in soybean

表3 大豆RIL群體4個再生性狀相關性分析Table 3 Correlation analysis of four traits correlated with regeneration of RIL population in soybean

2.1.3 大豆再生性狀分布特點

本研究分析大豆RIL群體100個家系叢生芽誘導率、伸長率、生根率和成苗率分布特點（見圖3）。大豆叢生芽誘導率為22.41%～96.67% ，其中誘導率50%以上家系占66%，誘導率90%以上和30% 以下家系較少，分別占3%和2%，說明大部分家系再生誘導率較高，但無法用單一指標評價大豆家系再生能力。

大豆伸長率為0～93.33%，其中0～40%家系占62%；伸長率90%以上和10%以下家系較少，分別占1%和4%。說明大部分家系伸長率較低，可與誘導率結合篩選大豆再生率高家系。

大豆生根率為0～88.33%，其中40%以下家系占67%，生根率在80%以上家系較少，占2%。說明大部分家系生根率較低，在叢生芽伸長出枝條基礎上生根，所以生根率與伸長率變化趨勢接近。

大豆成苗率為0～80%，其中成苗率30%以下家系占65%，成苗率60%以上家系較少，占6%，說明大部分家系成苗率較低，成苗是在伸長和生根基礎上，導致成苗率與伸長率、生根率變化趨勢接近。移栽時受周圍環境條件和自身生長情況影響，可能導致部分移栽苗在生長過程中死亡，所以大豆再生成苗率偏低。

分析大豆RIL 群體4 個再生性狀頻數分布（見圖3），可看出，誘導率、伸長率、生根率和成苗率4個性狀均表現為連續單峰曲線，符合正態分布特征，因此，上述大豆再生性狀在RIL群體中分布屬于典型多基因數量遺傳。

圖3 大豆RIL群體4個再生性狀分布Fig.3 Distribution of four traits correlated with regeneration of RIL population in soybean

以母本合豐25、父本L-28 以及4 個家系HP116、HP115、HP93 和 HP92 為例，研究叢生芽誘導、叢生芽伸長、生根和移苗4個時期生長勢情況（見圖4），合豐25、HP116和HP115叢生芽誘導率為85.00%～96.67%，L-28、HP93和HP92叢生芽誘導率為22.50%～45.61%，再生率為HP116>合豐25>HP115>HP92>HP93>L-28。

2.1.4 大豆RIL群體再生優異家系篩選

本研究評價大豆RIL 群體100 個家系再生情況，篩選出8個再生情況較好家系（見表4）。

由表4可知，HP116誘導率和伸長率均達90%以上，生根率和成苗率達80%以上。HP30 誘導率為91.67%，伸長率為71.67%，生根率為65%，成苗率為56.67%。HP122 誘導率為90.57%，伸長率為84.21%，生根率為75.44%，成苗率為64.91%。HP77 誘導率和伸長率均達80%以上，生根率和成苗率達70%以上。HP115 和HP104 誘導率和伸長率均達80%以上，生根率70%以上，成苗率60%以上。HP4 和HP111 誘導率均達80%以上，伸長率和生根率均達70%以上，成苗率均達50%以上。這8 個家系可為選育高再生率大豆品種提供基礎材料。

圖4 大豆各時期生長勢情況Fig.4 Growth appearance of soybean at different stage

2.2 大豆RIL群體再生性狀QTL定位

2.2.1 RIL群體Bin map概況

大豆RIL 群體100個家系使用滑動窗口法作基因分型，并篩選每條染色體bin標記，共得到5 221個重組bin標記（見表5），覆蓋20 條染色體，全長6 458.02 cM。

其中6號染色體最長，為577.27 cM；16號染色體最短，為175.82 cM。18 號染色體包含bin 標記最多，為381 個；12 號染色體包含bin 標記最少，為161 個。平均兩個bin 間遺傳距離為1.24 cM，6號染色體平均遺傳距離最大，為1.96 cM；7 號染色體平均遺傳距離最小，為0.79 cM。

表4 大豆RIL群體中高再生率大豆家系Table 4 Soybean lines with high regeneration rate in RIL population

表5 RIL群體bin map概況Table 5 Summary of bin marker characteristic of RIL population

2.2.2 大豆RIL群體4個再生性狀QTL定位

通過對大豆RIL 群體4 個再生性狀QTL 定位，檢測到與誘導率顯著相關位點2個，分別位于4號和7 號染色體，貢獻率分別為11.11%、13.40%（見表6）。檢測到與伸長率顯著相關位點3 個，分別位于2號、7號和10號染色體，貢獻率為11.99%～13.48%。檢測到與生根率顯著相關位點3個，分別位于2 號、7 號和10 號染色體，貢獻率為12.67%～13.69%。檢測到與成苗率顯著相關位點2個，分別位于2 號和7 號染色體，貢獻率分別為12.01%和13.89%。

2.2.3 QTL定位穩定性和遺傳重疊分析

在大豆 RIL 群體4 個再生性狀10 個 QTL 位點中，可重復檢測到位點（即同時控制兩個以上再生性狀QTL位點）共3個（見表7）。可知，同時與伸長率、生根率QTL 位點1 個，位于10 號染色體上，左右標記分別為Block5160和Block5159。同時與伸長率、生根率和成苗率QTL 位點2 個，分別位于2 號和7 號染色體上，左右標記分別為Block385 和Block384、Block4036和Block4035。

表6 與大豆再生性狀顯著相關QTL位點Table 6 QTL loci significantly associated with soybean regeneration indicators

表7 控制不同性狀位點重疊分析Table 7 Overlap analysis for controlling different traits loci

3 討 論

3.1 不同基因型對大豆再生情況影響

大豆轉化率較低，僅為0.2%～10.0%，遠低于其他雙子葉植物如番茄、擬南芥、煙草等。大豆遺傳轉化對基因型依賴性較強，不同大豆基因型對農桿菌敏感程度有差異，選取敏感度較強品種轉化可提高轉化效率[17]。曲桂芹等選取8個大豆基因型誘導體細胞胚發生，確定合豐25 和東農7819為優選基因型[18]。楊明明等以墾農18、B12088 和東農47 等3 種不同基因型高油大豆品種子葉節為外植體作遺傳轉化，發現墾農18 為最佳轉化受體[19]。李換麗等選取10 個大豆品種探究基因型對大豆再生體系的影響，結果表明，晉豆37 號與中黃13 號在子葉節再生體系中再生能力比其他品種強，晉豆36號在胚尖再生體系中再生能力較強[20]。

本研究利用合豐25 與L-28 及其衍生RIL 群體為材料，評價大豆再生誘導率、伸長率、生根率和成苗率，篩選得到8個再生能力較強家系，分別是HP116、HP30、HP122、HP77、HP115、HP104、HP4和HP111，這些家系可為選育高再生率品種提供基礎材料。

3.2 大豆再生性狀QTL位點分析

利用組織培養技術建立再生體系是遺傳轉化和改良轉基因作物性狀的基礎。近年來，針對大豆遺傳轉化和再生體系已開展多項技術，但大豆仍是公認的難轉化作物之一。因為基因型、農桿菌菌株、培養環境、激素種類及濃度等條件均影響遺傳轉化效率。因此需研究不同大豆基因型再生能力遺傳基礎。Bolibok 等利用Nipponbare 和Kasalath 構建回交群體，定位5 個控制愈傷組織出芽率QTL 和4 個控制再生率QTL[21]。楊莉等以日本晴與瀘恢99及其構建RIL群體188個家系為研究對象，對同一地點兩年再生率及6個產量相關性狀基因定位，檢測到3 個與再生相關QTL[22]。王萌以172個擬南芥生態型為材料，以根為外植體，對F2代植株初級定位，結果表明，存在3個與性狀相關QTL，貢獻率分別為21.4%、27.37%和24.22%[23]。

本試驗利用合豐25（子葉節再生率較高）和L-28（子葉節再生率較低）雜交衍生RIL群體作QTL定位，發現10 個QTL 與大豆再生性狀顯著相關，其中獨立QTL 位點2 個，可重復檢測到QTL 位點3個。與誘導率顯著關聯QTL位點2個，與伸長率顯著關聯QTL位點3個，與生根率顯著關聯QTL 位點3 個，與成苗率顯著關聯QTL 位點2 個。7 號染色體上存在與大豆4個再生性狀相關QTL位點，說明該染色體上可能存在與再生相關基因簇。根據不同性狀重疊位點標記區間內查找出的候選基因，后續將選取與再生相關基因作實時熒光定量，采用同源重組法作相關基因克隆。目前關于大豆子葉節再生系統QTL 定位尚未見報道，本研究定位的QTL 位點貢獻率均在10%以上，說明這些QTL位點調控的基因可能參與大豆子葉節再生過程，研究結果將有助于建立大豆遺傳轉化系統。

4 結 論

a.在大豆RIL 群體4 個再生性狀中，誘導率與伸長率、生根率和成苗率均呈極顯著正相關，伸長率與生根率和成苗率呈極顯著正相關，生根率與成苗率呈極顯著正相關。

b.大豆RIL群體叢生芽誘導率主要分布在50%～60%，且誘導率50%以上家系占66%，伸長率和生根率主要分布在30%～40%，成苗率主要分布在20%～30%。4個性狀均表現為連續單峰曲線，符合正態分布特點。

c.在大豆RIL群體中共檢測到10個與大豆再生性狀顯著相關QTL 位點，其中獨立QTL 位點2 個，可重復檢測QTL位點3個。與誘導率顯著相關QTL位點2個，與伸長率顯著相關QTL 位點3個，與生根率顯著相關QTL 位點3 個，與成苗率顯著相關QTL位點2個。