茯磚茶金花發酵劑的制備工藝優化

曹 霞， 劉永翔， 黃永會， 任錫毅， 鄒 曉， 譚玉梅*

(1.貴州大學 生命科學學院/農業生物工程研究院， 山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室， 山地生態與農業生物工程協同創新中心， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省農業生物技術重點實驗室， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】茯磚茶(Fuzhuan Brick Tea)屬于一種后發酵黑茶，具有獨特的品質和風味，至今已有超過600年的悠久歷史，產銷量在黑茶市場中占據著重要的地位[1]。茯磚茶具有健胃消食、降脂減肥、降血壓等多種保健功效[2-4]。肖文軍等[5-7]研究表明，茯磚茶具有降脂減肥的作用。黃群等[8]研究表明，茯磚茶對人體胃腸消化功能具有調理作用。茯磚茶因具有較多的保健功效和投資價值，越來越受商業人士的青睞[9]。茯磚茶制作流程包括黑毛茶制備、渥堆、氣蒸、二次渥堆、發花干燥和成品包裝等[10]。形成茯磚茶品質的最關鍵工藝是發花，該工藝是金花菌—冠突曲霉在茶葉中繁殖代謝的過程，該過程不僅能夠改善茶葉的外觀、色澤、香氣及口感等，還能夠產生對人體有益的活性代謝產物[11]。因此，金花菌的數量和顆粒的飽滿度是決定發花品質的重要參數之一[12]。貴州的夏秋茶資源豐富，黑茶產業具有良好的發展前景，目前，貴州對黑茶的研究很少，且產品結構單一，貴州黑茶企業普遍存在發花周期短，發花過程容易污染，發花工藝不成熟，沒有統一的制作標準等問題。有研究發現，人工接種可以改善茯磚茶品質，而金花菌發酵劑的制備是人工接種的關鍵。對茯磚茶金花發酵劑的制備工藝進行研究，對改善茯磚茶品質具有重要意義。【前人研究進展】目前，針對發花技術的改進，大多數采用人工接種液體發酵劑、孢子液、孢子粉和添加誘發劑[13]，這些制作方法都相對比較復雜，不適宜工廠化推廣。【研究切入點】目前，大多數利用固體培養方法，該方法具有操作方便，儲存時間長等優點。為此，采用固體培養方法，對茯磚茶金花發酵劑的制備進行研究。【擬解決的關鍵問題】通過單因素試驗設計考察不同含水量、接種量與蔗糖含量對發酵劑產孢量的影響，并利用響應面法對發酵劑的配方進一步優化，以期縮短發花時間提高發花孢子濃度，為茯磚茶的工藝改良和品質提升提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：金花菌—冠突曲霉(Aspergilluscristatus)，由中國科學院菌種保藏中心和貴州省農業生物技術重點實驗室共同保存，中國科學院菌株保藏號：CGMCC 7.193；黑毛茶由貴州過江龍生態黑茶(集團)有限公司提供。

5%NaCl MYA培養基：稱取酵母5 g、麥芽糖20 g、蔗糖30 g、NaCl 50 g、攪拌混勻，然后加瓊脂1.5～1.7 g，蒸餾水定容至1 000 mL，混勻，121℃滅菌20 min，取出冷卻后貯存備用。

儀器設備：高壓滅菌鍋，日本TomyKogyo公司；超純水系統，Purelab公司；超凈工作臺、搖床、BSS300-WEI電子天平，德國賽多利斯；各種規格的移液槍，Eppendorf；常溫冰箱，海爾集團；電熱恒溫培養箱、廣口瓶、燒杯等其他小型儀器均為國產儀器。

1.2 方法

1.2.1 金花菌孢子懸浮液的制備 將活化后的金花菌接種至5%NaCl MYA培養基，28℃培養7 d；在超凈工作臺上刮取冠突曲霉孢子，放入無菌三角瓶內，倒入一定量的無菌水，放入適量滅菌的玻璃珠，150 r/min，震蕩30 min；過濾菌液，利用血球計數板計數，保存于4℃冰箱備用[14]。

1.2.2 單因素試驗 稱取10 g黑毛茶，裝于滅菌三角瓶內，添加不同含水量(20%、24%、28%、32%、36%、40%)，蔗糖含量(0、1%、2%、3%、4%、5%)及接種量(160 μL、200 μL、240 μL、280 μL、320 μL、360 μL)；除考察因素外，其余條件均為含水量28%，蔗糖含量2%，接種量為240 μL，溫度28℃下培養10 d，取出，45℃烘干1 d，測量孢子量，確定各單因素最佳水平，3次重復。

1.2.3 金花菌發酵劑孢子濃度的測定 取1 g發酵劑，加入9mL無菌生理鹽水，150 r/min下震蕩30 min，2層紗布過濾，40 mL無菌水多次沖洗，將孢子液稀釋100倍。用血球計數板計數。

孢子數(個/g)=總孢子數/(5×25×104)×100，式中5×25×104為血球計數板的格子數，100為稀釋倍數。

1.3 響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，以含水量(A)、蔗糖含量(B)及接種量(C)為試驗因素，以孢子量為響應面值，進行3因素3水平響應面試驗，其因素水平見表1。

表1 茯磚茶金花發酵劑制備的響應面試驗因素及水平

1.4 統計分析

采用Excel和SPSS對試驗結果進行統計與分析。

2 結果與分析

2.1 不同因素對金花發酵菌產孢量的影響

從圖1可知，不同含水量、蔗糖含量及接種量的金花發酵菌產孢量變化。

2.1.1 含水量 水分含量是影響茯磚茶發花的重要條件之一[15]。隨著含水量的增加，產孢量呈先增后減趨勢。當含水量達32%時，其產孢量最大，為21.52×107個/g，比含水量為20%時高近10倍。說明含水量對發酵劑產孢量的影響較大。

圖1 不同含水量、蔗糖含量和接種量的金花菌產孢量

2.1.2 蔗糖含量 蔗糖能為微生物提供能量及營養物質。當蔗糖添加量為2%時產孢量最大，為19.13×107個/g，比沒有添加蔗糖的孢子含量高1倍多；當蔗糖添加量為3%時，產孢量緩慢下降，為17.21×107個/g，說明適宜的蔗糖含量有利于孢子產量的提高，但當蔗糖含量過大時，高濃度的蔗糖可能會形成一定的滲透壓，抑制菌絲的生長，影響產孢量[19]。

2.1.3 接種量 當接種量為200 μL時，其產孢量為7.5×107個/g。接種量低時，孢子數較少，產孢量低。當接種量為320 μL時，產孢量最大，為17.74×107個/g；當接種量為400 μL時，發酵劑產孢量逐漸降低。這是由于當接種量過大時，孢子數較多，培養基中的營養物質不能滿足微生物的需要，抑制了菌體的生長，因此產孢量呈下降趨勢[14]。

2.2 響應面試驗優化茯磚茶金花發酵劑的制備工藝

2.2.2 不同因素的交互作用 當等高線圖形呈橢圓形時交互作用顯著，呈圓形時交互作用不顯著。通過模型回歸方差分析表明，一次項A對發酵劑產孢量影響不顯著(P=0.318 3)，而B(P=0.008 4)和C(P=0.005 7)對發酵劑產孢量影響顯著；交互項AB(P=0.141 8)對發酵劑產孢量影響不顯著，等高線接近圓形(圖2)； AC(P<0.000 1)及BC(P<0.000 1)對發酵劑產孢量影響極顯著，等高線接近橢圓形(圖2)；二次項A2(P<0.000 1)、B2(P<0.000 1)及C2(P<0.000 1)對發酵劑產孢量影響極顯著。由P值可知，各因素對發酵劑產孢量影響的順序依次為接種量(C)>蔗糖含量(B)>含水量(A)。

表2 響應面試驗各處理茯磚茶金花發酵劑的產孢量

圖2 不同因素交互作用的響應面圖和等高線圖

2.2.3 最佳條件的確定及驗證 在獲得非線性回歸模型后，為求得最大產孢量，所得回歸擬合方程各自變量求一階偏導數，求得次方程得到最大產孢量最優條件為A=0.005、B=0.025、C=0.046換算成實際值為含水量31.96%、蔗糖2.98%、接種量321.92 μL，預測的最大產孢量為27.36×107個/g。

將響應面優化后的發酵條件進行3次驗證試驗，其產孢量分別為2.63×108個/g、27.6×107個/g和26.9×107個/g，與預測結果27.36×107個/g基本一致，表明該模型準確性且實用性高，能夠預測產孢量。

3 討論

茯磚茶的發花工藝對茯磚茶的品質至關重要，與傳統的自然發花相比，添加金花菌發酵劑能縮短散茶發花時間、有效抑制雜菌的生長。1991年，黃建安[16]將2種誘發劑YFJ1和YFJ2添加到茯磚茶中；2007年，楊秀芳等[17]將天然助花劑添加到茯磚茶中；2009年，張睿[18]發明了一款直投式紅茶菌發酵劑；2012年，呂嘉櫪等[19]發明了一種茯磚茶孢子粉；結果都發現對發花作用比較顯著，并有利于產品和品質的改變，可以縮短發酵周期，且有降低雜菌的污染等作用。但由于在發花過程中外源物添加量過大，不適合工業化生產；2014年，羅冰[20]利用麩皮、碳源物質及NaCl等物質制備發酵劑；2018年，周國慶等[14]在前人研究的基礎上優化了培養基配方，以含水量、氯化鈉濃度及接種量制備液體培養基及對發花促進效果較好等。但是每次接種都需要洗金花菌的孢子液，儲存時間也較短，不利于工廠化推廣。

制備發酵劑要嚴格控制無菌環境外，影響發酵劑的內在因素也很多，其涉及到制備工藝的每個環節。其中含水量是影響發酵劑的重要條件之一，金花菌—冠突曲霉只有吸收了茶葉中的營養成分才能生長，營養和吸收都需要以水為介質[21]；賈洪信等[22]研究散茶發花主要因素發現，蔗糖處理對發花有一定的影響，加糖直接提供了冠突曲霉的營養條件且有利于發花，但大規模生產中加糖，發花成本較高；接種量是影響散茶發花的一個重要指標，歐陽梅等[23-25]在茯磚茶散茶發花的技術研究表明，菌液接種能提高發酵茶的有益菌數量，同時提高了茶葉的感官品質，是提高發酵茶質量和產量的有效途徑[13]。但直接用菌液接種有可能加大污染幾率、操作過程繁瑣以及需要大量的菌液。

在前人的研究基礎上，開發了新型發酵劑，通過單因素試驗及響應面試驗優化發酵劑最優配方。研究結果表明，茯磚茶金花發酵劑的最佳制備條件為以10 g黑毛茶為基質，添加含水量31.96%、蔗糖含量2.98%、接種量321.92 μL，28℃條件下，培養10 d，該條件下的產孢量可達27.36×107個/g。

4 結論

直接用黑毛茶為基質的發酵劑相對于利用麩皮等為基質要簡單，使用便利、儲藏時間長且成本更低，優化的工藝參數經濟可行，孢子產量更高及發花品質較好，更加適宜進行工廠化推廣應用，可為下一步茯磚茶散茶發花的工業生產提供基礎。