貴州火龍果潰瘍病病原菌鑒定及生物學特性

趙曉珍， 柏自琴， 王 荔， 李興忠， 鄭 偉， 王 彬

(貴州省農業科學院 果樹科學研究所， 貴州 貴陽 550006)

0 引言

【研究意義】火龍果潰瘍病是一種真菌性病害，危害大，對貴州火龍果潰瘍病病原菌進行鑒定，并開展生物學特性研究，對該病害的防治及提高貴州火龍果品質具有重要的實際意義。【前人研究進展】火龍果潰瘍病在火龍果上發生最為普遍和嚴重，在我國廣西、廣東、臺灣、貴州等地普遍發生[1-5]，在馬來西亞、以色列、美國等國家均有發生[6-8]。火龍果潰瘍病主要危害火龍果枝條及果實，發病初期在莖及果實上形成褪綠色小點，嚴重時病斑連成片，后期病斑突起，濕度大時，病斑邊緣形成水浸狀，不斷擴大，腐爛，潰瘍病的發生嚴重影響火龍果的產量和品質。近年來，火龍果潰瘍病病原菌研究受到關注，有研究表明，在馬來西亞以及我國臺灣、廣東、海南等地引起火龍果潰瘍病的病原菌為Neoscytalidiumdimidiatum[9-10]。【研究切入點】貴州省火龍果種植面積約6 500 hm2，規模位居全國第5位，種植主要分布在羅甸、鎮寧、關嶺、貞豐、望謨等低熱河谷地區。隨著貴州火龍果種植面積的不斷擴大，火龍果病害發生日趨嚴重，主要病害有炭疽病、黑斑病、枯斑病等[11-13]。近幾年，貴州火龍果主產區大面積發生火龍果潰瘍病，嚴重影響了貴州火龍果的品質和產量[1]，而目前未見貴州火龍果潰瘍病的相關研究報道。【擬解決的關鍵問題】采用常規組織分離法、形態學與分子生物學鑒定相結合，對火龍果病原菌進行分離、鑒定，并開展病原菌生物學特性研究，明確引起貴州省火龍果潰瘍病的病原，為該病的防治及病原菌的碳氮源代謝研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病植株樣品 火龍果品種為黔蜜龍，病樣于2018年采于貴州省鎮寧縣。

1.1.2 試劑與儀器 Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒為上海生工生物工程股份有限公司生產，Takara Ex Taq Hot Start Version為寶生物工程有限公司生產，D-葡萄糖、硫酸鈉、磷酸二氫鉀均為Sigma公司生產。Biolog PM系統，PMl、PM2和PM3微孔板，FF-IF接種液。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 采集病樣植株，用自來水和無菌水沖洗干凈后，采用常規組織分離法[14]取病健交界處3 mm×3 mm的組織，于75%的酒精中浸泡3 s，5%次氯酸鈉溶液浸泡4～5 min，再用滅菌水洗4～5次，于滅菌濾紙上干燥后置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基平面上，于26℃培養箱中進行培養。待組織周圍長出菌落后，挑取菌落邊緣菌絲進行純化。

1.2.2 病原菌的致病性測定 將分離出的H1菌株于28℃培養箱中培養5 d，在菌落邊緣取5 mm的菌餅，采用針刺接種法將菌餅接種于刺傷的火龍果莖上，以接種無菌PDA培養基塊的火龍果莖作對照，置于保鮮盒中，于28℃培養箱中恒溫保濕培養，每處理3次重復，觀察發病情況，對回接試驗中發病的火龍果莖進行再次分離、鑒定，根據柯赫氏法則確定H1菌株是否為致病菌株。

1.2.3 病原菌的鑒定

1) 形態學鑒定。將純化后的致病菌株H1接種于PDA培養基上，于28℃培養箱中恒溫培養，觀察菌落形態，顯微鏡觀察分生孢子形態，并記錄拍照。

2) 分子生物學鑒定。采用PDA培養基培養菌株H1，收集菌絲，采用Ezup柱式真菌基因組DNA試劑盒，按說明書提取菌株H1的基因組DNA；采用真菌ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[15]對H1菌株基因組DNA進行rDNA-ITS基因擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送上海生工生物工程有限公司純化后進行測序。測序結果通過NCBI進行比對分析，獲得高相似性菌株，采用MAGA 6.0軟件比對校正后，采用Neighbor-Joining法構建系統進化樹。

1.2.4 病原菌生物學特性鑒定

1) 溫度。將在PDA培養基上培養3 d的病原菌，用直徑為5 mm的滅菌打孔器打取菌餅，將菌餅接種于備用PDA培養基中，分別置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃、45℃的恒溫培養箱中黑暗培養3 d，每處理重復3次，用“十字交叉法”測量菌落直徑。

2) pH值。將直徑為5 mm的病原菌菌餅分別接種于pH為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0的PDA培養基上，28℃恒溫培養箱中黑暗培養3 d，每處理重復3次，用“十字交叉法”測量菌落直徑。

3) 光照。設置5種光照條件，分別為24 h黑暗、24 h光照、12 h黑暗/12 h光照、紫外光5 min+24 h光照、紫外光+12 h黑暗/12 h光照。將直徑為5 mm的病原菌菌餅接種于PDA培養基上，再分別置于不同光照條件下培養3 d，每個處理重復3次，用“十字交叉法”測量菌落直徑。

4) 碳氮源的利用。采用Biolog表型芯片技術，參考WANG等[16-17]的方法測定火龍果潰瘍病菌對PM碳氮源代謝。將致病菌株H1于PDA培養基上28℃黑暗培養3 d，用少量無菌蒸餾水洗下分生孢子，配制1×105個/mL的孢子懸浮液。用FF-IF接種液調整孢子懸浮液濃度，使其透光度為62%T(T為Biolog標準濃度單位)，將孢子懸浮液分別接種至PMl、PM2微孔板中，每孔100 μL；往62%T孢子懸浮液中加入葡萄糖，磷酸二氫鉀和硫酸鈉，使其在孢子懸浮液中的終濃度分別為100 mmol/L、5 mmol/L和2 mmol/L，再將此孢子懸浮液接種至PM3微孔板中，每孔100 μL。將PMl、PM2和PM3板置Biolog系統培養箱中28℃培養5 d，由OmniLog 2.4系統每15 min讀數1次。

1.3 數據分析

采用MAGA 6.0對火龍果潰瘍病病菌的rDNA-ITS序列數據進行處理和構建進化樹，通過SPSS 24進行單因素方差分析，采用鄧肯氏新復極差(DMRT)法進行差異顯著性分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 火龍果潰瘍病癥狀

從圖1看出，火龍果潰瘍病主要危害火龍果莖及果實，發病初期在莖及果實上形成褪綠色小點，逐步擴大形成褪綠斑，嚴重時病斑連成片，褪綠斑逐漸變成黃色和紅色，后期病斑突起，濕度大時易受其他病原侵入，病斑邊緣不斷擴大，黃化腐爛。

2.2 病原菌分離及致病性

采用組織分離法分離得到優勢菌株H1，采用刺傷接種法將分離純化后的菌株H1接種至健康火龍果枝條上，接種5 d后癥狀明顯，接種菌餅部位均有明顯病斑，且周圍產生褪綠小點；8 d后接種部位逐漸擴大，病斑凸起明顯；18 d后病斑周圍逐步擴大黃化腐爛，與田間癥狀相似，而對照未見明顯病斑。從接種后發病的部位重新分離，觀察菌落、孢子形態等結果與菌株H1一致，說明分離出的H1菌株為火龍果潰瘍病病原菌。

圖1 火龍果潰瘍田間癥狀

2.3 病原菌鑒定

2.3.1 形態特征鑒定 H1菌株在PDA培養基上菌落呈圓形，邊緣較整齊，在28℃條件下生長迅速，氣生菌絲發達，細絨毛狀，菌落初期灰白色(圖2A-B)；3 d以后培養基逐漸變黑，7 d時培養基完全變為黑綠色(圖2C-D)。病原菌在培養過程中，菌絲會斷裂形成節孢子鏈，節孢子無隔膜或有隔膜(圖3A)；分生孢子形態多樣，有圓形、橢圓形、桿狀等，有隔膜或無隔膜(圖3B)。根據H1菌株的菌落形態和顯微形態，與報道的火龍果潰瘍病原菌新暗色柱節孢(Neoscytalidiumdimidiatum)相似[3,10]，初步確定致病菌株H1為新暗色柱節孢菌。

注：A、B分別為培養3 d菌落的正、反面，C、D分別為培養7 d菌落的正、反面。

注：A為節孢子鏈，B為分生孢子。

2.3.2 分子生物學鑒定 將致病菌株H1的rDNA-ITS序列在NCBI數據庫中進行BLAST比對分析，結果(圖4)顯示，菌株H1與Neoscytalidiumdimidiatum(登錄號：HQ439174.1，JX473739)的相似性達99%以上。選取已報道的火龍果潰瘍病菌(Neoscytalidiumdimidiatum)(登錄號：JX524168.1、KF812550)[10, 18]以及在李和杏上發現的Neoscytalidiumdimidiatum[19-20](登錄號分別為MH676062、MK788362)，采用MAGA 6.0軟件經過比對校正后，用Neighbor-Joining法構建系統發育樹，結果(圖4)表明，致病菌株H1與Neoscytalidium dimidiatum處于同一分支，與Neoscytalidiumdimidiatum的異名屬Scytalidium的不同種處于不同分支。結合形態學分析，確定引起貴州火龍果潰瘍病的病原為新暗色柱節孢(Neoscytalidiumdimidiatum)。

圖4 菌株H1基于rDNA-ITS基因的系統發育樹

2.4 病原菌生物學特性

2.4.1 不同溫度下病原菌的生長情況 從表1看出，病原菌在PDA平板上生長3 d時，不同溫度下菌落直徑差異明顯，病原菌菌絲在20～40℃下均能生長，最適溫度為28℃，菌落直徑達71.50 mm，顯著大于其他溫度條件。溫度高于35℃和低于20℃時生長受到明顯抑制；45℃和15℃時菌絲停止生長。說明病原菌相對耐高溫。

2.4.2 不同pH下病原菌的生長情況 從表2看出，培養3 d時火龍果潰瘍病病原菌在培養基pH 4～10中均可生長，最適pH為6～7，菌落平均直徑分別為73.6 mm和72.5 mm，無顯著性差異。pH為10時菌落平均直徑為27.3 mm， pH為4時為59.5 mm。

表1 病原菌在不同溫度下生長的菌落直徑

表2 火龍果潰瘍病病原菌在不同pH下生長的菌落直徑

2.4.3 不同光照條件病原菌的生長情況 從表3看出，火龍果潰瘍病病原菌在不同光照條件下均能生長，而在連續光照、連續黑暗、光暗交替條件下病原菌菌落大小有顯著差異。連續黑暗條件下菌落直徑顯著大于光照和光暗交替條件。說明光照對菌絲生長有一定的抑制作用，但短時間的紫外光照射對菌絲生長有促進作用。

表3 火龍果潰瘍病病原菌在不同光照條件下生長的菌落直徑

2.4.4 碳氮源種類利用 通過代謝表型組學分析(圖5)，火龍果潰瘍病病原菌對PMl、PM2微孔板中190種碳源物質的平均利用率為18.42%，利用較好的碳源為b-甲基-D-葡萄糖苷、L-半乳糖酸-g-內酯、D-半乳糖醛酸、丙二酸等32種。PM3微孔板中95種氮源物質的平均利用率為52.63%，利用較好的為L-色氨酸、丙氨酸-天冬氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺、丙氨酸-蘇氨酸、甘氨酸-天冬酰胺等32種。對PMl、PM2微孔板中利用較多的碳源物質分別為12種和20種，對PM3微孔板中氮源物質利用較多的有32種(表4)。

圖5 火龍果潰瘍病菌對PM1、PM2微孔板中碳源及PM3微孔板中氮源的代謝圖譜

3 討論

火龍果潰瘍病是火龍果上發生最為嚴重的病害之一，在馬來西亞、以色列、弗洛里達州等地及我國臺灣、廣東、廣西、海南均有報道[4-10]，病原主要為新暗色柱節孢(Neoscytalidiumdimidiatum)。本研究通過分離、致病性測定、形態學觀察以及ITS序列分析，明確引起貴州火龍果潰瘍病的病原為新暗色柱節孢(Neoscytalidiumdimidiatum)，與已報道的火龍果潰瘍病病原一致。張榮等[21]研究表明，火龍果潰瘍病在病原菌溫度為32～34℃，pH為3～4的酸性環境下生長最快。易潤華等[10]研究表明，火龍果潰瘍病病原菌在25～35℃為適宜生長溫度，30℃為最佳生長溫度，pH為8時菌絲生長速度最快，光照促進菌絲生長，黑暗條件利于產孢。戴俊等[22]研究表明，火龍果潰瘍病病原菌最佳生長溫度為28℃，生長環境偏酸性。本研究結果表明，貴州火龍果潰瘍病病原菌在20～40℃均能生長，最佳生長溫度為28℃，溫度在35℃時病原菌落明顯大于20℃，即病原菌較耐高溫；病原菌在pH 4～10均可生長，最適宜生長的pH為6～7，生長環境偏酸性；黑暗條件利于病原菌的生長，與以上報道的病原菌適宜高溫、偏酸性環境的整體趨勢一致，但仍然存在差異，這可能與各地生產環境差異有一定關系。

4 結論

貴州火龍果潰瘍病病原為新暗色柱節孢(Neoscytalidiumdimidiatum)；病原菌較耐高溫，最佳生長溫度為28℃，最適宜生長的pH為6～7，生長環境偏酸性；黑暗條件利于病原菌的生長。火龍果潰瘍病原菌對PMl、PM2微孔板中190種碳源物質的平均利用率為18.42%，利用較好的碳源為b-甲基-D-葡萄糖苷、L-半乳糖酸-g-內酯、D-半乳糖醛酸、丙二酸等32種；對PM3微孔板中95種氮源物質的利用率為52.63%，利用較好的為L-色氨酸、丙氨酸-天冬氨酸、丙氨酸-谷氨酰胺、丙氨酸-蘇氨酸、甘氨酸-天冬酰胺等32種。研究結果對貴州火龍果潰瘍病的防治及潰瘍病菌與火龍果植株互作過程中病原菌的碳氮源代謝研究奠定了理論依據。