扶正口服液通過STAT3-RORγt信號通路對胃癌小鼠Th17細胞的調控作用

王理槐 孫銀輝

【關鍵詞】胃癌;扶正口服液;信號轉導與轉錄激活因子3;維甲酸相關核孤兒受體γt;輔助性T細胞17

近年來，有關胃癌患者其輔助性T細胞17（T helper cell 17，Th17）、信號轉導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）及維甲酸相關核孤兒受體γt（retinoid-related orp han nuclear receptor γt，RORγt）表達增加的報道相繼涌現[1-2]。基礎研究亦證實了白細胞介素-17（IL-17）具有較強促瘤作用，IL-17抑制劑或可成為胃癌治療的新思路[3]。扶正口服液是我院腫瘤科長期臨床探索中研制而成的院內制劑，該方以李東垣“補脾胃、瀉陰火”學說為指導，具有健脾益氣、活血散結之功。本研究基于本院采用扶正口服液輔助治療胃癌的確切療效，研究扶正口服液通過STAT3-RORγt信號通路調控胃癌荷瘤小鼠Th17細胞分化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥物

SPF級KM小鼠50只，雌雄各半，體重18～22 g，6～8周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。動物使用符合我校《實驗動物管理規定》。

扶正口服液每1000 mL含：莪術220 g、生丹參147 g、當歸147 g、黃連44 g、蒲公英440 g、白花蛇舌草440 g、黨參147 g、蜜麩炒白術147 g、生甘草88 g、制半夏147 g、陳皮88 g、白茯苓176 g。將扶正口服液以生理鹽水稀釋至0.45 g/ mL，根據換算系數，小鼠等效給藥量為0.2 mL/10 g，并依此設置低劑量、中劑量、高劑量（0.1 mL/10 g、0.2 mL/10 g、0.4 mL/10 g）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養

將人胃癌細胞株SGC-7901置于含10%滅活胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養液中，細胞單層貼壁生長至80%～90%融合時以0.25%胰蛋白酶消化，按1∶3傳代，于37℃、5%CO2、濕度合適的細胞培養箱中培養。

1.2.2 動物造模

取對數生長期的人胃癌SGC-7901細胞株，在無菌條件下分別用0.25%胰蛋白酶消化制備成3×107個/mL細胞懸液，以0.1 mL/只接種于50只裸小鼠右側腋窩下。待腫瘤生長至100～200 mm3后，選取合適裸小鼠40只備用。

1.2.3 分組及給藥

將40只荷瘤小鼠隨機分為空白組，陽性對照組（5-FU組），低、中、高劑量組，每組8只。空白組：生理鹽水灌胃，每次劑量為0.2 mL/10 g，1次/d;另腹腔注射生理鹽水，每次劑量為0.1 mL/10 g，2次/周。5-Fu組：將5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）以生理鹽水稀釋至5 mg/mL，腹腔注射給藥，每次劑量為0.1 mL/10 g，2次/周;另以生理鹽水灌胃，每次劑量為 0.2 mL/10 g，1次/d。低、中、高劑量組：生理鹽水稀釋后的扶正口服液灌胃，低、中、高劑量組每次劑量分別0.1 mL/10 g、0.2 mL/10g、0.4 mL/10 g，1次/d;另腹腔注射生理鹽水，每次劑量為0.1 mL/10 g，2次/周。給藥28天后，將小鼠摘除眼球取血，手術剝取瘤塊。

1.3 指標觀察

瘤體體積：給藥前后測量瘤體最長徑（a）和最短徑（b），并根據公式V=πab2/6（mm3）算出瘤體體積。

腫瘤抑制率：計算腫瘤的生長抑制率=（Cweight-Tweight） /Cweight×100%，Tweight為給藥組小鼠體積、Cweight為空白組小鼠平均體積。

STAT3、RORγt 信使RNA（mRNA）的表達：采用RT-PCR法檢測，將腫瘤組織剪碎并加入Trizzol冰上勻漿，抽提RNA并測定濃度，進行RT-PCR反應，檢測STAT3 RORγt mRNA的表達情況。反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃25 s，55 ℃ 25 s，72 ℃ 50 s，72 ℃5 min，循環次數為40，設GAPDH作為內參照。引物設計見表1。

STAT3、RORγt的蛋白表達：采用Western Blot法檢測，將腫瘤組織剪碎后加入RIPA裂解液并在冰浴條件下超聲勻漿裂解后加入PMSF及Complete 液，4℃12000rct離心15min得到蛋白樣品，應用BCA分析試劑測定蛋白濃度，50 μg蛋白質在SDS-PAGE 電泳分離，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗4℃過夜，TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次。以GAPDH蛋白的表達為內參照。

血清IL-17、IL-22、IL-6水平采用ELISA法檢測，試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，操作嚴格按照說明書執行。

1.4 統計學方法

應用SPSS 22.0軟件處理，計量資料采用（x—±s）表示，多組間比較采用方差分析。檢驗水準為α=0.05，當P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組瘤體體積比較

給藥后，5-FU組，低、中、高劑量組瘤體體積均小于空白組，5-FU組瘤體體積均小于低、中劑量組，5-FU組瘤體生長抑制率均高于低、中劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.2 各組STAT3、RORγt mRNA表達情況

中、高劑量組STAT3、RORγt mRNA表達量均低于空白組、5-FU組、低劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

2.3 各組STAT3、RORγt蛋白表達情況

中、高劑量組STAT3、RORγt蛋白蛋白表達均低于空白組，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖1。

2.4 血清Th17相關炎癥因子水平

低、中、高劑量組血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于空白組，中、高劑量組血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于5-FU組和低劑量組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表4。

3 討論

根據胃癌臨床表現，可將其歸屬于中醫“積聚”范疇，其多由飲食不節日久致胃失和降或痰熱毒瘀交阻于胃而成，病機總屬虛實夾雜，因此當健脾益氣以補虛，活血散結以祛邪[4]。

本研究中，給藥后，5-FU組，低、中、高劑量組瘤體體積均小于空白組，5-FU組瘤體體積均小于低、中劑量組，5-FU組瘤體生長抑制率均高于低、中劑量組。表明中、高劑量的扶正口服液對于胃癌小鼠均有抗癌抑瘤作用，劑量越高，效果越明顯，高劑量的扶正口服液效果與胃癌常用的抗腫瘤藥5-氟尿嘧啶無明顯差別。扶正口服液組成為莪術、丹參、當歸、黃連、蒲公英、白花蛇舌草、黨參、白術、半夏、陳皮、茯苓、甘草。其中黨參、當歸可補氣養血，白術、茯苓健運脾胃，以除胃癌病久之虛，莪術、丹參活血行氣，半夏、陳皮燥濕化痰，蒲公英、白花蛇舌草散結消癥，與黃連合用還可清熱解毒，甘草調和諸藥，固護胃氣，諸藥合用則補氣養血與健脾護胃并舉，痰、濕、瘀、熱、毒共治，扶正與祛邪兼顧[5-7]。

研究證實[8-9]，Th17在胃癌患者中明顯升高，其釋放的炎性介質可促進腫瘤新生血管的形成，同時還可導致Th17/Treg的免疫失衡，進而加重胃癌患者的免疫抑制，促進胃癌細胞的生長、侵襲。Th17細胞主要分泌IL-17、IL-22、IL-6等促炎因子發揮促炎作用，誘導腫瘤進展，同時IL-6分泌過多，還可使抑炎因子TGF-β負相調控T細胞，使其向Th17分化，減少Treg細胞數量，加重機體炎癥反應[10-11]。而STAT3-RORγt信號通路與Th17的分化及促炎機制密切相關，STAT3是Th17增殖的信號轉導通路代表因子，而RORγt則是其特異性轉錄因子，當STAT3功能亢進時，STAT磷酸化增加，并可提高bcl-2和bcl-xL對機體炎癥細胞的抗凋亡作用，促進T淋巴細胞增殖及毒性T細胞反應，進而增加Th17細胞的分化及加重機體炎癥損傷。此外，STAT3上調還可激活RORγt的過度表達，已有研究[12]顯示，RORγt缺乏小鼠，其Th17細胞數量明顯低于正常小鼠，而在初始T細胞中加入編碼RORγt的逆轉錄病毒，可明顯促進IL-17、IL22等Th17相關因子的分泌。

本研究還顯示中、高劑量組STAT3、RORγt mRNA均低于空白組、5-FU組和低劑量組，蛋白表達量均低于空白組，此外，低、中、高劑量組血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于空白組，中、高劑量組血清IL-17、IL-22、IL-6水平均低于5-FU組和低劑量組。表明扶正口服液可通過下調STAT3、RORγt表達，抑制Th17細胞分化，減少Th17相關細胞因子分泌，抑制Th17細胞分化，進而發揮抗癌作用，其效果與劑量相關，較低劑量時無明顯作用。而5-氟尿嘧啶則無此調控作用，其抗癌機制與扶正口服液并不相同。

綜上所述，高劑量扶正口服液可下調STAT3、RORγt的表達，進而抑制胃癌小鼠Th17的分化發揮抑瘤作用。