人誘導多能干細胞分化來源心肌細胞特征及促成熟方法研究進展

劉明璐 綜述 王偉 付煒 審校

【提要】 人誘導多能干細胞分化來源的心肌細胞(Human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes，hiPSC-CMs)為心臟修復、心臟藥物測試、體外心臟建模等提供了理想細胞來源。但hiPSC-CMs與心肌細胞相比并不成熟，表現在缺乏某些特定基因表達，結構、代謝、電生理不成熟，Ca2+處理水平低等方面。許多研究都聚焦于促進hiPSC-CMs成熟的方法，包括生化刺激、物理刺激、共培養、3D培養、miRNA等。本文對hiPSC-CMs特征及其促成熟方法進行綜述，并展望該領域的發展方向。

心血管疾病是人類健康的頭號殺手，尤其是心肌梗死及其導致的心力衰竭。心肌細胞受損后再生能力有限，受損的心肌細胞被非收縮性瘢痕組織替代，形成無法正常收縮的薄心室壁，隨后引發了一系列重塑、肥大并最終導致心力衰竭。因此，干細胞來源心肌細胞的替代療法有望成為修復受損心肌的方法[1]。

誘導多能干細胞(Induced pluripotent stem cells，iPSCs)是由Yamanaka[2]等在2006年由體細胞重編程而來的多能干細胞，可分化成包括心肌細胞在內的多種不同細胞類型，為精確的疾病建模、體外藥物測試和臨床再生醫學提供了新的研究手段。iPSC向心肌細胞分化的最初方案是采用擬胚體的方法，但效率十分低下。隨后的研究發現，Gsk3抑制劑和Wnt信號在心臟發育和心肌細胞分化中發揮重要的作用。早期Wnt信號可以增強心臟發育，而晚期Wnt信號則抑制心臟發育。目前，通過先使用Gsk3抑制劑激活典型Wnt信號，然后再加入Wnt信號抑制劑抑制心臟發育，平面誘導心肌細胞分化的效率可高達82%～98%。然而，這種分化而來的心肌細胞并不完全成熟[3]。

1 hiPSC-CMs的特征

人誘導多能干細胞分化來源的心肌細胞(Human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes，hiPSC-CMs)的不成熟主要表現為缺乏特定基因表達，其結構、代謝、電生理不成熟和Ca2+處理水平低等。

1.1 基因表達特征

hiPSC-CMs表現出缺乏特定基因表達的特征。成熟心肌細胞表達高水平的基因，如有關心肌細胞收縮性的MYH7(肌球蛋白重鏈7)、N2B(肌聯蛋白)、cTnⅠ(肌鈣蛋白Ⅰ)；有關鈣處理的ATP2A2(肌漿網ATP酶)，CACNA1C(L-型電壓依賴鈣離子通道α1C亞基)[4]；有關電生理的KCNJ2(鉀離子通道蛋白)，SCN5A(鈉離子通道蛋白)[5]等。以上基因在hiPSC-CMs均呈現低表達，此外hiPSC-CMs高表達MYH6(肌球蛋白重鏈6)、N2A(肌聯蛋白)，而非MYH7(肌球蛋白重鏈7)和N2B(肌聯蛋白)。這些特征體現了hiPSC-CMs的未成熟性[6]。

1.2 結構特征

相比于成熟心肌細胞，hiPSC-CMs顯示出其結構的不成熟性。成熟心肌細胞呈棒狀，顯示出很高的長寬比，長度約150 μm，寬度約20 μm，并且25%～30%是雙核的，線粒體占細胞體積的30%；此外，成熟心肌細胞有完整的肌節結構，有T管、肌漿網、Z-線、I-帶、H-帶、A-帶和M-線，肌節長度約2.2 μm。而hiPSC-CMs傾向于圓形，長度約30 μm，寬度約10 μm，通常是單核的，肌節結構不完整，肌節長度約1.6 μm，只有Z-線和I-帶，沒有T管和肌漿網[7]。

1.3 代謝特征

hiPSC-CMs的能量產生和代謝方式也與成熟心肌細胞有差異。成熟心肌細胞消耗的總能量的80%是由脂肪酸的β-氧化提供，具有高水平的氧化磷酸化，而hiPSC-CMs主要依賴糖酵解，脂肪酸代謝只占15%左右。單位質量的脂肪酸代謝比碳水化合物代謝產生更多ATP，更有利于支持心肌細胞的收縮功能。

此外，成熟心肌的線粒體數量多，且內部具有密集的嵴，增大了線粒體內膜的表面積，線粒體嵴上有許多線粒體基粒，基粒中含有ATP合成酶，能利用呼吸鏈產生的能量合成ATP。而hiPSC-CMs中的線粒體數量少，僅占細胞體積5%左右，沒有線粒體嵴，氧化磷酸化水平低[8]。

1.4 電生理特征

hiPSC-CMs與成熟心肌細胞相比有電生理不成熟的特征。在心臟發育過程中，心肌細胞不同離子通道的位置、功能、表達水平發生改變，最終形成成熟的離子通道表型。心肌細胞的電位是離子通過肌膜離子通道向內和向外流動的結果，成熟心肌細胞的靜息電位約-90 mV，在被相鄰細胞的去極化觸發之前處于電靜止狀態，但在受到刺激時則具有更強的收縮力、更快的傳導速度和動作電位上升速度，且具有平臺期。但hiPSC-CMs的靜息電位約-60 mV，高度自發跳動，具有較低的超極化作用[9]，且INa、Kcnj2編碼的IK1和IKr不成熟，在受到刺激時收縮力較弱，傳導速度和動作電位上升速度較慢，并且不具有平臺期[10]。

1.5 Ca2+處理特征

hiPSC-CMs的Ca2+處理水平低下。Ca2+在心肌細胞收縮、信號傳遞、新陳代謝和轉錄調節中具有重要作用。因此，成熟心肌細胞具備高效的Ca2+處理系統，心肌細胞收縮時，去極化沿肌膜及其內陷T管傳播，開放L型鈣通道，導致細胞外鈣內流，鈣與肌鈣蛋白C結合后啟動肌絲滑動和肌肉收縮；心肌細胞舒張時，ATP2A2(肌漿網ATP酶)將鈣攝取回肌漿網，并通過鈉鈣交換器將鈣輸出到細胞外。相比之下，hiPSC-CMs的Ca2+處理系統尚未完善，缺乏T管、Ca2+處理蛋白(如L型鈣通道蛋白)和Ca2+緩沖蛋白等，并且Ca2+達到峰值的時間長，Ca2+信號衰減慢[11]。

2 促進hiPSC-CMs成熟的方法

hiPSC-CMs的未成熟性是目前應用的一大障礙，比如hiPSC-CMs電生理不成熟性可能是細胞替代療法中導致動物模型心律失常的基礎。因此，促進hiPSC-CMs成熟是hiPSC-CMs應用于精準疾病建模、體外藥物測試和臨床再生醫學的關鍵。目前，促進hiPSC-CMs成熟有生化刺激、物理刺激、共培養、3D培養、miRNA等方法[1，12]。

2.1 生化刺激

2.1.1 小分子刺激

三碘甲狀腺原氨酸(T3)、糖皮質激素可以促心肌細胞成熟。Feaster等[12-14]發現，T3影響肌球蛋白重鏈和肌漿網ATP酶表達，使關鍵成熟標志表達增高、細胞體積增加、肌節長度更長、收縮力和線粒體呼吸能力增強。糖皮質激素通過促進過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子(PGC-1α)的表達[15-16]，改善肌纖維結構，增加心肌細胞收縮力、耗氧量和離子通道表達水平[16]。以T3和地塞米松共培養在進一步促進hiPSC-CMs的成熟狀態方面已獲得一定程度的效果，當hiPSC-CMs與這兩種小分子共同培養15 d時，形成了廣泛的T管網絡，Ca2+處理水平提高，這是成熟心肌細胞的關鍵指標[17]。

2.1.2 代謝底物

改變hiPSC-CMs的代謝底物也可以促進心肌細胞成熟。成熟心肌細胞消耗的80%的總能量是由脂肪酸的β-氧化提供的，而hiPSC-CMs能量提供主要依賴于糖酵解，脂肪酸代謝只占15%左右。Horikoshi等[18]模仿成熟心肌細胞以脂肪酸為主要代謝底物的代謝方式，在hiPSC-CMs分化20 d后，用棕櫚酸培養3～7 d，處理后的hiPSC-CMs肌節長度增長，動作電位的上升速度加快且持續時間延長，收縮力和線粒體氧化磷酸化水平增強，各種成熟相關基因也表現出高表達[19-20]。研究發現，低葡萄糖培養的hiPSC-CMs，其心肌細胞的結構、代謝和功能更加成熟，低葡萄糖可以抑制缺氧誘導因子1α(HIF1α)，增加hiPSC-CMs的氧化磷酸化水平[21-22]。

2.2 物理刺激

2.2.1 電刺激

電刺激是體外刺激hiPSC-CMs成熟最有效的手段之一。Shen等[23-24]使用體外電起搏系統來模擬心肌細胞收縮性的改變。電刺激可以激活L型鈣通道，提高細胞內Ca2+水平，從而增強心肌細胞收縮性。研究發現，逐漸增強的電刺激比起固定頻率的電刺激能更好地促進成熟。Ma等[25-26]在1周內將電刺激頻率從1 Hz逐漸提高到6 Hz，結果增加了hiPSC-CMs各方面的成熟度，肌節長度增加，鈣的處理水平改善，動作電位傳導速度增快，誘導了更負的靜息膜電位和增加了動作電位振幅。

在細胞基質膠中添加導電材料也可以促進hiPSC-CMs成熟。研究表明，氧化石墨烯可以增強凝膠的導電性，導致hiPSC-CMs動作電位傳導速度增快和鈣處理能力增強。聚吡咯殼聚糖能夠改善分離的大鼠心肌細胞之間的電信號傳播，并使之同步收縮。電刺激是實現hiPSC-CMs成熟的一個重要手段，通過導電基質膠來促進hiPSC-CMs成熟，有待進一步深入的研究[27]。

2.2.2 機械刺激

成熟心肌細胞主要受到三種類型的機械刺激，包括心臟充盈時的被動拉伸、血流動力學負荷和心臟主動收縮力。Abilez等[28]利用計算模型和聚二甲基硅氧烷來建立被動拉伸組織，將hiPSC-CMs、人成纖維細胞和Ⅰ型膠原蛋白混合形成的工程化心肌，加入聚二甲基硅氧烷容器中，通過不同間距的立柱將工程化心肌被動拉伸5 mm、7 mm、9 mm，其中被動拉伸7 mm的hiPSC-CMs成熟度更高，細胞肌節排列更整齊，鈣處理水平增強，成熟基因表達增加，包括ADRB1、ADRB2(β-腎上腺素能受體1、2)、CAV3(鈣調蛋白3)、KCNJ2(鉀離子通道)、CACNA1C(鈣離子通道)以及TNNT2(肌鈣蛋白T)。Ruan等[29-30]將hiPSC-CMs分化后分兩組進行2周的機械靜態應力刺激(通過維持固定的長度)，觀察到實驗組細胞排列性、收縮性、拉伸性增強，細胞體積增加。

改善血流動力學負荷也可以促進hiPSC-CMs成熟。微流控系統，是一種精確控制和操控微觀流體，尤其是亞微米結構流體的系統，通過微流控系統可以模擬心肌的血流動力學負荷。Kolanowski等[31]改進了微流控系統，采用封閉式微流控循環系統和氧氣交換器來實現和維持培養室中的低氧環境。微流控系統中培養的hiPSC-CMs細胞體積增加，肌節長度變長，排列性和收縮性更好，線粒體的密度增加，形狀更加接近成熟心肌細胞的外形[22，31-32]。

Ronaldson-Bouchard[27，33-34]使用逐漸增強的電刺激(在2周內將頻率從2 Hz增加到6 Hz)和機械刺激來處理hiPSC-CMs，觀察到處理后的hiPSC-CMs具有完整的T管，肌節長度增長，線粒體數量增加。結果表明，機械靜態應力刺激和電刺激可促進hiPSC-CMs的成熟狀態，但目前通過機械刺激和電刺激促進hiPSC-CMs成熟的機制尚不完全清楚，可能與上調心肌細胞結構和收縮的關鍵基因的表達有關，例如在施加靜態壓力后鈣處理基因SERCA2和RYR2的表達增加[27，34]。

2.3 共培養

Yoshida等[1，3]的研究表明，與間充質干細胞(MSCs)共培養可以促進hiPSC-CMs的成熟。將hiPSC-CMs與hMSC共培養3 d，結果共培養的hiPSC-CMs的結構、收縮力、電生理和代謝能力均有改善，生成了A-帶、H-帶和I-帶，并且細胞間相互作用增強[35]。此外，MSCs分泌的可溶性因子(VEGF、bFGF、SDF-1和GM-CSF)和外泌體，可上調關鍵的成熟心肌細胞基因MYH7的表達，不僅如此，外泌體中的miRNA和蛋白質還可以影響hiPSC-CMs的功能和成熟度，更引人注意的是，由hiPSC-CMs和MSCs的混合物組成的細胞片顯示出更長的存活時間[36]。

2.4 3D培養

心肌是由心肌細胞、細胞外基質和血管內皮細胞不斷相互作用的3D結構。通過3D培養可以使hiPSC-CMs體外培養更加接近體內環境，增強細胞間接觸，3D培養和/或物理刺激可以增強心肌細胞的成熟度[13，37]。

2.4.1 水凝膠

水膠凝由膠原蛋白、基質膠、纖維蛋白、藻酸鹽獨立或混合組成，具有促進細胞黏附和生長的能力，是心臟組織工程中使用最廣泛的基質。此外，水凝膠的某些特性高度類似心臟組織的微環境，不僅可以為心肌細胞提供機械支持，還可以幫助心肌細胞形成具有穩定支撐的3D結構。此外，對水凝膠進行物理和化學修飾還可以增強其性能，形成具有氧釋放、彈性體和導電特性的新一代水凝膠[25]。

2.4.2 改善細胞外基質

目前有兩種方法被用來改善細胞外基質，即在支架中添加基質蛋白和調節底物剛度。2D培養是靜態的，而心臟的細胞外基質是一個復雜的動態結構，由于缺乏細胞外基質，2D培養無法產生成熟的心肌細胞表型。Vanwinkle等[38]開發了一種包含心肌成纖維細胞、層黏連蛋白、纖連蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白以及蛋白聚糖的3D基質，在3D基質上培養的hiPSC-CMs比2D培養更早顯示出成熟的表型，包括自發性收縮、肌原纖維增多和細胞骨架分化等。

Feaster等[12]比較了鋪在濃縮基質膠上的hiPSC-CM的成熟狀態與傳統稀釋基質膠上的hiPSC-CM的成熟狀態，發現在濃縮基質膠上培養的細胞，其收縮力增強，編碼肌原纖維蛋白的基因表達增加，肌節排列更整齊，去極化能力增強。

2.4.3 3D培養結合電刺激

3D培養結合電刺激可以更好地促進hiPSC-CMs成熟，有研究將3D培養結合電刺激來促進成熟hiPSC-CMs，將分化的hiPSC-CMs種植到含有聚二甲基硅氧烷通道和膠原凝膠的絲狀基質上進行3D培養，培養1周后，細胞出現自發收縮，然后給細胞電刺激，被刺激的細胞表現出鈣處理能力的改善、肌原纖維組織的增加以及更快的傳導速度[25，39-40]。以上結果表明電刺激結合3D培養有利于促進hiPSC-CMs成熟。

2.4.4 3D培養結合機械刺激

3D培養結合機械刺激，也可以提高hiPSC-CMs成熟度。研究表明，在3D基質(膠原蛋白1和基底膜蛋白的水凝膠)上對hiPSC-CMs進行機械拉伸可以更快地提高心肌細胞成熟度，具有與肌質網相連的T管、更快的上升速度以及在Ca2+流入期明顯的平臺期[41]。

3D培養促進hiPSC-CMs成熟，可能是其通過提供更接近體內心臟發育的環境，增加了細胞間接觸[32]。雖然3D培養前景看好，但仍有一些尚無法克服的問題。首先，許多疾病模型需要使用單細胞模型來表征疾病表型，但3D培養的hiPSC-CMS消化后重種植存活率低，其次，細胞數量和心肌組織大小還需要進一步優化。最后，培養前需要進行細胞分選來確保細胞均一性[31]。

2.5 miRNA

研究發現，miRNA是心臟發育和功能的關鍵調節因子，在心肌細胞的增殖和凋亡過程中起著重要作用[42]。在干細胞分化過程中，miR-1、miR-133、miR-208、miR-499和let-7miRNA家族與心肌成熟密切相關。Kuppusamy等[43]在長時間的2D培養中篩選出與hESC-CMs成熟相關的miRNA，發現hESC-CMs中Let-7 miRNA家族成員的過表達顯著增加了細胞體積、肌節長度，增強了收縮力，并誘導糖酵解代謝向脂肪酸代謝的轉換。將miRNA“雞尾酒”法(包括Let7i和miR-452的過表達以及miR-122和miR-200a的低表達)用于hiPSC-CMs，結果促進了hiPSC-CMs成熟，細胞收縮力增強，細胞體積增大，脂肪酸代謝能力增強[44]。有研究表明，hiPSC-CMs與內皮細胞共培養可促進其成熟，表現為細胞體積和雙核化增加，靜息膜電位更負，動作電位幅度更大，部分機制是通過上調miR-125b-5p、miR-199a-5p、miR-221和miR-222水平[20]。

3 展望

hiPSC-CMs在許多領域都顯示出了巨大的潛力，例如心臟再生療法、心臟藥物毒性測試及心臟疾病模型。目前已經可以高效獲得純度超過90%的hiPSC-CMs，但這些心肌細胞的基因表達、結構、代謝、電生理、鈣處理都是不成熟的， hiPSC-CMs的未成熟性嚴重阻礙其進一步的應用。因此，近年來有許多研究聚焦于促進hiPSC-CMs的成熟，包括生化刺激、物理刺激、共培養、3D培養、miRNA等，但這些單一的方法并不能生成完全成熟的心肌細胞。

成熟不是單一的特點，而是由細胞質和細胞核多個信號網絡調控的復雜的特征。因此，調整一個信號通路或信號網絡可能不會對另一個信號網絡有影響，需要聯合應用幾種方法才能更好地促進成熟，例如，機械刺激和電刺激的組合可增強細胞收縮力，3D培養結合機械刺激和電刺激能增強細胞形態和功能成熟度，3D培養結合帶凹槽結構的導電復合水凝膠、3D培養結合細胞外基質和共培養、3D培養結合“小分子混合物”和“miRNA雞尾酒法”等多種促進成熟方法的組合有望產生更成熟的hiPSC-CMs。此外，使用CRISPR/Cas9技術進行基因編輯高效設計細胞表型來促進hiPSC-CMs成熟，也值得進一步研究[45]。簡而言之，我們希望通過各種促成熟方法的組合使得hiPSC-CMs在特定基因的表達、結構、代謝、電生理學和Ca2+處理等方面更加接近成熟心肌細胞。

綜上所述，促進hiPSC-CMs成熟的各種方法有望為hiPSC-CMs的臨床應用開辟新的篇章，但迄今為止仍存在相當大的局限性，例如未成熟性、臨床相容性和干細胞移植損傷等問題仍待解決。未來需要進行更廣泛的研究，開發出有效產生大規模成熟hiPSC-CMs的最佳方法。隨著技術的不斷進步，hiPSC-CMs將在心血管研究及治療領域占據重要地位。