增強成骨及抗菌性能的魚膠原/聚乙烯亞胺電紡膜用于牙周組織修復

朱敏聞 孫兵 李志耀 葉周熹 錢文昊 吳玉波

慢性牙周炎是發生在牙齒周圍支持組織的一種慢性炎癥性病變，其特征是牙周組織由于受到細菌等致病原的侵襲而引起的組織炎癥反應，往往會導致牙周骨組織界面的喪失、骨組織吸收和牙體松動。牙周治療的基本目的是防止牙周組織進一步破壞，并修復或再生已破壞組織。

近年來，通過翻瓣清創并使用牙周膜實現牙周組織重建的引導組織再生(Guided tissue regeneration，GTR)技術在臨床得到廣泛應用。該技術是通過阻隔成纖維細胞和上皮細胞向缺損牙周的入侵作用，從而為缺損牙周組織的重建提供足夠空間[1]。迄今為止，雖然偶有通過GTR膜實現臨床牙周組織再生的報道，但該技術的治療結果并不理想，在某些特殊情況下GTR膜甚至沒有任何治療效果[2]。理想的GTR膜應同時具有成骨及抗菌兩大特性，而傳統的GTR膜僅起到物理阻隔的作用，這正是導致牙周組織修復失敗的主要原因[3]。

因此，如何制備同時具有成骨及抗菌性能的GTR膜成為牙周組織修復的關鍵。為了使GTR膜具有抗菌性能，有研究推薦引入Al2O3和TiO2納米顆粒，但其細胞毒性對牙周組織再生構成很大的風險[4]。使用聚合物作為添加劑是賦予GTR膜抗菌性能的另一種策略。超支化陽離子聚合物聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)可穿透細菌的細胞壁并破壞其細胞膜。羅非魚皮來源的魚膠原(Fish collagen，FC)，來源廣，價格低，富含多種氨基酸，具有良好的細胞親和性及良好的骨誘導性[5]。因此，本實驗擬通過靜電紡絲技術制備FC/PEI復合膜，通過接種骨髓間充質干細胞(Bone morrow stem cells，BMSCs)以驗證其細胞相容性和成骨誘導能力，同時研究其對典型的革蘭陰性菌(銅綠假單胞菌)和具有代表性的革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌)的抑菌效果，討論FC/PEI復合膜作為GTR膜進行牙周組織修復的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

胰蛋白酶、成骨誘導培養基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B、PBS(Hyclone公司，美國)；相對分子質量為1 800的PEI(Sigma公司，美國)；茜素紅試劑盒(Sigma-Aldrich公司，美國)；CCK-8檢測試劑盒(Abcam公司，美國)。

磁力攪拌器(鞏義予華儀器有限責任公司)；精確微量注射泵(LSP01-1 A，保定市蘭格恒流泵有限公司)；靜電紡絲儀器(KDS-100型， Le-Parmer公司，美國)；靜電紡絲高壓電源(天津市東文高壓電源廠)；真空冷凍干燥儀(上海實驗室儀器有限公司)；場發射掃描電子顯微鏡(SEM；S-4800型， JEOL公司，日本)。

1.2 FC和FC/PEI電紡膜的制備

將羅非魚魚皮洗凈，用粉碎機絞碎后混勻。用羅非魚魚皮質量20倍的0.1 mol/L的NaOH溶液浸泡24 h，以去除雜蛋白；用蒸餾水洗至中性，再用其質量2倍的10%的乙醚浸泡24 h，反復兩次，共脫脂48 h；脫脂完成后，經蒸餾水反復洗滌，瀝干，用等質量的0.5 mol/L的乙酸溶液浸泡3 d；4 400 r/min離心20 min后取上清，凍干得到魚膠原粉末。隨后將0.8 g魚膠原粉末均勻溶解于10 mL六氟異丙醇中制成8%的FC紡絲液(FC組)，將0.7 g魚膠原粉末和0.1 g PEI的混合物均勻溶解于10 mL六氟異丙醇中制成8%的FC/PEI紡絲液(FC/PEI組)。將上述兩組紡絲液分別置于精確微量注射泵中，連接靜電紡絲儀。調整靜電紡參數：電壓15 kV，推進速度0.6 mL/h，接收距離15 cm，室溫25 ℃，環境濕度40%～50%；行混合靜電紡絲，以鋁箔接收。將得到的靜電紡絲置入含有25%戊二醛蒸汽的密閉容器皿中熏蒸30 min，使其充分交聯，最終真空凍干24 h，制得FC和FC/PEI電紡膜。

1.3 FC和FC/PEI電紡膜的形貌檢測

將FC和FC/PEI電紡膜用環鉆裁減為0.6 cm直徑的圓片，單反相機進行大體觀拍照。將FC和FC/PEI電紡膜噴金后，在SEM下觀察其結構特點及納米纖維排布情況，用Image J軟件進行電紡絲纖維直徑分布分析。

1.4 BMSCs在兩種電紡膜上的增殖情況

10 mL注射器吸入含肝素的生理鹽水2 mL，于新西蘭大白兔股骨髁處穿刺入股骨髓腔，反復緩慢輕揉沖洗髓腔，獲取含BMSCs的混懸液。按BMSCs常規分離培養方法，獲得第2代BMSCs并制備成5.0×105個/mL的細胞混懸液，均勻接種于FC和FC/PEI電紡膜上，37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養4 h后，加入普通培養基體外培養9 d，每兩天換液1次，以觀察BMSCs在FC和FC/PEI電紡膜上的增殖情況。BMSCs-電紡膜復合物體外培養1 d后，經過脫水和噴金進行掃描電鏡(SEM)檢測，觀察BMSCs在電紡膜上的生長形態。BMSCs-電紡膜復合物體外培養第1、5、9天時進行CCK-8定量檢測，以觀察BMSCs在電紡膜的增殖情況。檢測方法參照試劑盒說明書。

1.5 BMSCs-電紡膜的成骨性能檢測

取上述第2代BMSCs并制備成5.0×105個/mL的細胞混懸液，均勻接種于FC和FC/PEI電紡膜上，37 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養4 h后，加入成骨誘導培養基體外培養14 d，每兩天換液1次。分別于體外成骨誘導第7天和第14天使用TRIzol reagent提取各組細胞總RNA，調整其濃度為1 g/L，用反轉錄試劑盒進行反轉錄，得到的cDNA模板用于real time RT-PCR反應以檢測成骨相關基因RUNX-2、ALP、OPN和OCN的mRNA表達水平。按照SYBR Green Ex Taq體系，以GAPDH為內參基因，定量PCR儀檢測，采用MxPro軟件對結果進行分析(引物序列見表1)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.6 茜素紅鈣結節染色

BMSCs-電紡膜復合物成骨誘導14 d后，用體積分數95%或100%的乙醇(提前4 ℃預冷處理)固定10 min，PBS漂洗2次，加入茜素紅染液，于37 ℃孵箱中染色30～45 min。棄去多余染液后以去離子水沖洗，鏡下觀察。

1.7 抗菌性能檢測

參照紡織品抗菌性能的評價方法(GB/T20944；紡織品抗菌性能的評價第1部分：瓊脂擴散法)，采用抑菌圈法對電紡膜的抗菌性能進行測試。分別將FC和FC/PEI電紡膜剪成直徑為10 mm的圓片，用紫外燈照射滅菌30 min；分別將銅綠假單胞菌(革蘭陰性菌)和金黃色葡萄球菌(革蘭陽性菌)菌液適量稀釋后涂布到瓊脂培養基上，然后將FC和FC/PEI電紡膜分別均勻按壓在瓊脂培養基左右兩側，充分接觸后放入37 ℃的培養箱中培養24 h，觀察試樣周邊細菌的生長情況，平行實驗重復3組。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 FC和FC/PEI電紡膜制備

純FC電紡膜和FC/PEI復合電紡膜具有相似的白色大體觀(圖1A1、B1)。SEM檢測進一步證實FC和FC/PEI電紡膜具有類似的微觀結構，隨機交錯的電紡纖維使電紡絲呈多孔結構(圖1A2、B2)。基于SEM圖像，我們隨機檢測了FC和FC/PEI電紡膜各100～120根電紡纖維的直徑分布，結果顯示兩組電紡纖維直徑分布無明顯差異，均集中在0.2～0.8 μm(圖1A3、B3)。

2.2 FC和FC/PEI電紡膜的細胞相容性

第2代BMSCs在培養皿中生長良好，傳代培養后的第3～5天細胞增殖明顯(第3天細胞融合率約60%，第5天細胞融合率約90%)，進一步說明BMSCs具有良好的細胞活力(圖2A、B)。收集傳代至第5天的BMSCs，分別接種于FC和FC/PEI電紡膜，1 d后電鏡觀察顯示BMSCs在兩種電紡膜上黏附良好，細胞呈伸展狀態，說明細胞在兩組電紡膜中均生長良好(圖2C、D)。CCK-8法檢測結果顯示，BMSCs在兩種電紡膜中的增殖曲線與對照組(單純體外培養的BMSCs)相似(圖2E)，說明BMSCs在兩組電紡膜中均保持良好的細胞活力。以上結果證實FC和FC/PEI電紡膜均具有良好的細胞相容性，有望進一步用于牙周組織再生。

A1、B1：大體觀；A2、B2：電鏡圖；A3、B3：粒徑分布。A1, B1: Gross views; A2, B2: SEM images; A3, B3: Fiber diameter distribution.圖1 FC和FC/PEI電紡膜的形貌分析Fig. 1 The morphology of FC and FC/PEI membrane

2.3 FC和FC/PEI電紡膜的成骨誘導能力

BMSCs-FC和BMSCs-FC/PEI體外成骨誘導7 d和14 d后，采用RT-PCR定量檢測RUNX-2、ALP、OPN和OCN，以接種于培養皿的BMSCs為對照組。結果(圖3)顯示，4種成骨標志基因在FC組和FC/PEI組中的表達均明顯高于對照組，并且隨著體外成骨誘導時間的延長(第7～14天)，這4種成骨標志基因的表達量明顯增加。值得注意的是，FC和FC/PEI組的OCN表達量在第7天均未明顯增高，這可能是因為OCN出現在成骨細胞分化的末期，為晚期成骨細胞標志物，所以在第14天的時候出現明顯升高。

茜素紅染色檢測鈣結節的結果顯示，BMSCs在FC和FC/PEI電紡膜體外成骨誘導14 d后，兩組復合物均呈明顯強陽性，而對照組為陰性(圖3E)。

上述結果表明FC和FC/PEI電紡膜具有良好的成骨誘導能力，可望用于牙槽骨組織再生。

A：第2代BMSCs培養3 d的光鏡圖；B：第2代BMSCs培養5 d的光鏡圖；C：BMSCs接種于FC電紡膜1 d后的電鏡圖；D：BMSCs接種于FC/PEI電紡膜1 d后的電鏡圖；E：增殖曲線。A: Light microscopy of P2 BMSCs cultured for 3 days; B: Light microscopy of P2 BMSCs cultured for 5 days; C: SEM image of BMSCs incubated on FC membrane for 1 day; D: SEM image of BMSCs incubated on FC/PEI membrane for 1 day; E: Growth curves.圖2 BMSCs接種于FC和FC/PEI電紡膜的細胞相容性Fig. 2 Cytocompatibility of BMSCs cultured on the FC and FC/PEI membrane

A～D：體外培養7 d和14 d后RUNX-2、ALP、OPN、OCN的相對表達量；E：體外培養14 d后茜素紅染色結果。A-D: The mRNA expression of RUNX-2, ALP, OPN and OCN after in vitro culture for 7 days and 14 days; E: Alizarin red S staining after in vitro culture for 14 days.圖3 BMSCs-電紡膜體外培養7 d和14 d后的成骨分化情況Fig. 3 Osteogenesis of BMSCs after in vitro cultured on FC and FC/PEI membrane for 7 and 14 days

2.4 FC和FC/PEI電紡膜的抗菌性能

將FC和FC/PEI電紡膜圓片分別置于銅綠假單胞菌(革蘭陰性菌)和金黃色葡萄球菌(革蘭陽性菌)的瓊脂板上，37 ℃恒溫培養1 d后，結果顯示FC/PEI電紡膜圓片在銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌周邊均形成明顯的抑菌圈(圖4B)，而FC電紡膜圓片周邊均未見抑菌圈(圖4A)，說明FC/PEI電紡膜具有顯著的抗菌性能。

A：銅綠假單胞菌瓊脂板；B：金黃色葡萄球菌瓊脂板。A: P. Aeruginosa seeded agar plate; B: Staphylococcus aureus seeded agar plate.圖4 FC和FC/PEI電紡膜的抗菌性能Fig. 4 The antibacterial activity of the FC and FC/PEI membrane

3 討論

GBR膜材料的選擇是決定其引導牙周組織再生效果的關鍵。由于口腔微環境的復雜性，牙周炎除了典型的牙槽骨破壞外，還常伴有細菌感染。因此，理想的GTR膜除了物理阻隔的作用外，還應具有引導骨質再生及抗菌的能力。在所有可吸收性膜中，膠原膜因具有很強的生物活性和生物功能、較高的細胞黏附水平、一定的生物降解率，同時具有較弱的抗原性和良好的生物相容性，已經成為臨床上最常用的可吸收膜[6]。大多數膠原膜的膠原成分來源于豬、牛等陸生哺乳動物，由于口蹄疫等傳染病，人們逐漸對此種來源的膠原蛋白制品產生了懷疑[7]。此外，某些宗教信仰也限制使用豬、牛等來源的制品，這使傳統膠原蛋白制品的使用受到了一定的限制。因此，尋找安全性較高的新型膠原蛋白成為關注的熱點。魚膠原蛋白來源于水生生物，相較于陸地生物污染小、病毒傳播風險低、安全性更高。因此，魚膠原蛋白有望作為新型膠原用于GTR膜。研究表明，魚膠原可以促進人牙周膜細胞的成骨相關基因表達[5]。本研究結果進一步表明魚膠原來源的電紡膜還可以促進BMSCs的成骨相關基因表達，如RUNX-2、ALP、OPN及OCN等。

盡管目前制備的電紡膜絕大多數都具有良好的生物相容性，但易被細菌定植，尤其是口腔植入物。附著在膜上的細菌迅速繁殖形成生物膜進而保護細菌種群，對抗菌藥物和治療產生耐藥性[8]。聚乙烯亞胺(Polyethyleneimine，PEI)是一種具有良好生物相容性的非病毒陽離子載體。多項研究表明，PEI能夠作為真核細胞基因轉染的載體攜帶目的基因進入靶細胞，具有易修飾、低毒性、低免疫原性等優點，是當前受到廣泛關注的一類非病毒陽離子載體[9]。Beyth等[10]研究表明，負載于樹脂材料上的季銨PEI納米粒子在接觸時具有很強的抗菌活性，不會漏出納米粒子，也不會影響機械性能。Pietrokovski等[11-12]的研究表明，PEI抗菌納米顆粒與商業來源的材料混合可以實現強效抑菌，并且PEI作為新一代抗菌納米顆粒在修復牙齒時有希望防止細菌再污染。本研究通過典型的革蘭陰性菌(銅綠假單胞菌)和革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌)觀察了FC和FC/PEI電紡膜的體外抗菌能力。結果顯示，FC/PEI電紡膜表現出對銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的高效抑制作用，而FC電紡膜則未能表現出抑菌性能，提示PEI賦予了FC/PEI電紡膜的抑菌作用。我們推測FC/PEI誘導細菌死亡主要是通過靶向其膜或壁，并將在今后的研究中探索FC/PEI膜誘導的抗菌活性的相關機制。

綜上所述，本研究成功研制了一種FC/PEI電紡膜，該電紡膜具有良好的細胞相容性，能促進BMSCs的黏附、增殖和成骨分化，同時對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌具有一定的抑菌性。FC/PEI電紡膜具備成骨及抗菌的特性，有望將來應用于牙周組織的再生研究。