A型肉毒毒素在前列腺疾病中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展

胡平，陳平

(同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092)

自1989年美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)注射用A型肉毒毒素(botulinum toxin type A，BoNT/A)上市以來(lái)[1]，其應(yīng)用不斷拓展，目前已廣泛應(yīng)用于臨床治療，且在神經(jīng)系統(tǒng)疾病(肌張力障礙、痙攣、疼痛、自主神經(jīng)功能障礙等)[2]、美容[3]、泌尿系統(tǒng)疾病[4]、癌癥引起的局部疼痛以及癌癥手術(shù)放療部位疼痛的緩解[5]、抑郁癥[6]等中具有重要作用。近年來(lái)，BoNT/A在治療泌尿系統(tǒng)疾病方面的應(yīng)用越來(lái)越多，主要包括膀胱括約肌協(xié)同失調(diào)以及神經(jīng)性逼尿肌過(guò)度活動(dòng)引起的尿失禁，尤其對(duì)具有神經(jīng)源性膀胱過(guò)度活躍癥狀患者的療效較好[7]。臨床上，BoNT/A常被用于治療良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)、前列腺炎等。BPH發(fā)生時(shí)，間質(zhì)細(xì)胞增生、平滑肌細(xì)胞變得粗大且密集，上皮細(xì)胞增生主要表現(xiàn)為基底細(xì)胞的增生、肥大細(xì)胞由正常扁平變?yōu)榱⒎交虬鶢頪8]。BPH是造成中老年排尿障礙的一個(gè)重要原因，腺體增大會(huì)導(dǎo)致膀胱出口梗阻和下尿路癥狀等。而注射BoNT/A已成為臨床治療BPH患者的一種重要治療手段。目前治療前列腺炎的藥物主要包括抗菌藥物、抗炎藥物等，但均很難使患者痊愈。前列腺炎分為Ⅰ～Ⅳ型，其中Ⅲ型前列腺炎為慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征，BoNT/A對(duì)慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征治療效果較好[9]。現(xiàn)就BoNT/A在前列腺疾病中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展予以綜述。

1 肉毒毒素簡(jiǎn)介

1.1肉毒毒素結(jié)構(gòu) 肉毒毒素是由肉毒梭菌產(chǎn)生的一種神經(jīng)毒素蛋白，由肉毒神經(jīng)毒素和輔助蛋白組成；其分子量為150 000，由分子量為50 000的輕鏈和100 000的重鏈通過(guò)二硫鍵連接組成[10]。自然產(chǎn)生的肉毒毒素有7種，根據(jù)抗原性不同分為A、B、C、D、E、F和G型，其中BoNT/A應(yīng)用最多且毒性最強(qiáng)、作用時(shí)間最久。BoNT/A分子復(fù)合體的分子量為900 000，由分子量為150 000的神經(jīng)毒素和750 000的輔助蛋白組成，包含19種氨基酸[11]。

1.2BoNT/A作用機(jī)制 BoNT/A作用機(jī)制主要為BoNT/A輕鏈的內(nèi)切酶切割作為可溶性N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感性的融合蛋白附著蛋白受體復(fù)合體之一的突觸相關(guān)蛋白-25(synaptosomal-associated protein of 25 kDa，SNAP-25)，從而抑制突觸小泡與前膜融合，阻斷乙酰膽堿的釋放[12]。其作用過(guò)程主要分為：①BoNT/A重鏈與低親和力受體三涎酸神經(jīng)節(jié)苷脂結(jié)合，聚集細(xì)胞膜上的高親和力受體SV2(synaptic vesicle glycoprotein 2)，BoNT/A通過(guò)與低親和力及高親和力受體結(jié)合實(shí)現(xiàn)BoNT/A在細(xì)胞膜上聚集并形成胞內(nèi)體進(jìn)入胞質(zhì)內(nèi)；②BoNT/A輕鏈在胞內(nèi)體的酸性環(huán)境中被切割成具有內(nèi)切酶活性的肽段；③在ATP酶供能下，BoNT/A重鏈易位區(qū)插入胞內(nèi)體的脂質(zhì)雙分子層上形成細(xì)小通道供輕鏈釋放至胞質(zhì)；④輕鏈的內(nèi)切酶活性肽段可以水解位于靶膜上的SNAP-25，在SNAP-25 C端移除9個(gè)氨基酸殘基，導(dǎo)致可溶性N-乙基順丁烯二酰亞胺敏感性的融合蛋白附著蛋白受體復(fù)合體形成受阻，無(wú)法為膜融合提供能量，進(jìn)而影響突觸小體與突觸前膜的融合，導(dǎo)致乙酰膽堿等神經(jīng)遞質(zhì)無(wú)法釋放，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受阻[13]。除乙酰膽堿外，BoNT/A還可抑制突觸前膜釋放的去甲腎上腺素、降鈣素相關(guān)肽、P物質(zhì)和谷氨酸等[14]。

前列腺組織具有豐富的交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)，BoNT/A能夠作用于前列腺組織的原因?yàn)槠淇煞忾]局部交感神經(jīng)末梢分泌的腎上腺素和副交感神經(jīng)末梢分泌的乙酰膽堿。前列腺上皮細(xì)胞的過(guò)度增殖及平滑肌收縮均會(huì)導(dǎo)致前列腺疾病的發(fā)生，其中前列腺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)受副交感神經(jīng)調(diào)控，激活膽堿能受體可促進(jìn)前列腺上皮細(xì)胞生長(zhǎng)和分泌，而交感去腎上腺素能神經(jīng)主要負(fù)責(zé)調(diào)控前列腺平滑肌收縮[15]。可見(jiàn)，應(yīng)用BoNT/A治療前列腺疾病主要是通過(guò)其阻斷神經(jīng)的傳導(dǎo)。另外，BoNT/A還可促進(jìn)前列腺細(xì)胞凋亡，但具體機(jī)制目前尚不明確。

2 BoNT/A在BPH中的應(yīng)用

臨床上通過(guò)注射BoNT/A治療BPH，具有療效顯著、安全且耐受良好的特點(diǎn)。與應(yīng)用尿道前列腺電切術(shù)治療相比，前列腺內(nèi)注射BoNT/A治療可減小BPH患者前列腺體積、降低血清總前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)水平和殘余尿量[16]。與傳統(tǒng)藥物相比，BoNT/A具有更好的療效。如臨床治療發(fā)現(xiàn)，與抗膽堿能藥物相比，BPH患者膀胱逼尿肌注射BoNT/A療效更顯著[17]。關(guān)于BoNT/A治療BPH伴排尿功能障礙的Ⅲ期臨床試驗(yàn)表明，注射BoNT/A后患者尿道阻力顯著改善，其療效優(yōu)于安慰劑治療[4]。

2.1誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡 一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)，13例BPH患者在注射200 U BoNT/A 2個(gè)月后癥狀改善，且癥狀評(píng)分、血清PSA水平均降低，而3例注射0.9%氯化鈉注射液的BPH患者癥狀評(píng)分和血清PSA水平均無(wú)顯著變化[18]。在超聲引導(dǎo)下，給予32例BPH患者注射200 U BoNT/A，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療1個(gè)月后，臨床癥狀及殘余尿量、PSA水平、前列腺體積均顯著改善，且在治療后6個(gè)月達(dá)到最佳水平，BoNT/A的癥狀改善作用持續(xù)了至少1年[19]。對(duì)于藥物治療失敗、不適合或拒絕手術(shù)的45例BPH患者，經(jīng)直腸超聲法注射100 U BoNT/A至患者前列腺基底區(qū)和中段過(guò)渡區(qū)，結(jié)果顯示國(guó)際前列腺癥狀量表評(píng)分降低，排尿后殘余尿量減少，前列腺體積顯著減小，下尿路癥狀顯著改善[20]。在超聲引導(dǎo)會(huì)陰注射BoNT/A的77例BPH患者中，治療1個(gè)月后，41例患者主觀癥狀緩解；治療2個(gè)月后，55例患者主觀癥狀緩解；且與基線相比，患者美國(guó)泌尿外科學(xué)會(huì)評(píng)分、血清PSA水平、殘余尿量降低，前列腺體積減小，平均峰值尿流率升高[21]。

BoNT/A可通過(guò)促進(jìn)前列腺組織細(xì)胞凋亡減小前列腺體積。在前列腺增生模型大鼠的前列腺注射BoNT/A，前列腺的實(shí)際重量降低32.5%，回歸到正常前列腺重量水平[22]。有實(shí)驗(yàn)證明，前列腺增生大鼠前列腺重量減少是注射BoNT/A誘導(dǎo)前列腺組織細(xì)胞凋亡的結(jié)果，且隨著注射劑量的增加，前列腺腺體的重量不斷降低；同時(shí)，注射BoNT/A的前列腺增生大鼠B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)基因表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞表面死亡受體Fas和胱天蛋白酶(caspase)3表達(dá)上調(diào)[23]。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bcl-2家族成員和Fas/Fas配體信號(hào)通路起重要作用，而caspase-3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡通路的關(guān)鍵死亡蛋白酶。在大鼠前列腺內(nèi)注射BoNT/A后發(fā)現(xiàn)，前列腺上皮細(xì)胞Bcl-2樣蛋白1表達(dá)下調(diào)，caspase-3和Bcl-2相關(guān)X蛋白表達(dá)上調(diào)[24]。Bcl-2相關(guān)X蛋白屬于Bcl-2基因家族，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的功能。但BoNT/A誘導(dǎo)前列腺細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制目前尚不明確。

2.2抑制前列腺組織血管形成 BoNT/A還可抑制前列腺組織血管形成。前列腺增生組織的血管增生多分布于內(nèi)腺以及增生結(jié)節(jié)的內(nèi)部和周邊的前列腺間質(zhì)。在大鼠前列腺內(nèi)注射BoNT/A可通過(guò)抑制缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)，抑制前列腺組織的血管形成，促使前列腺體積縮小[25]。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌獲得的放療抵抗特性與缺氧誘導(dǎo)因子-1α具有的細(xì)胞修復(fù)和細(xì)胞增殖能力有關(guān)[26]。

2.3調(diào)控生長(zhǎng)因子 BoNT/A對(duì)生長(zhǎng)因子具有調(diào)控作用。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)主要聚集在前列腺基質(zhì)，其對(duì)前列腺上皮細(xì)胞具有負(fù)調(diào)控作用，TGF-β1水平升高可抑制細(xì)胞增殖，而水平降低可促進(jìn)細(xì)胞增殖[27]。在其他生長(zhǎng)因子存在時(shí)，TGF-β1不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但可使細(xì)胞生長(zhǎng)增殖停止[28]。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可以濃度依賴的方式促進(jìn)增生前列腺間質(zhì)細(xì)胞增殖，并抑制平滑肌細(xì)胞增殖，故TGF-β1/堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子比例失調(diào)是前列腺增生的重要發(fā)病機(jī)制[29]。在Wistar大鼠增生的前列腺組織中注射BoNT/A后，TGF-β1的表達(dá)上調(diào)，堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)下調(diào)，前列腺組織細(xì)胞凋亡增加[30]。與正常組織相比，增生前列腺組織中的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子水平顯著升高，而成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可促進(jìn)上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)[31]。另有研究發(fā)現(xiàn)，BoNT/A可抑制成纖維細(xì)胞增殖，同時(shí)還可促進(jìn)其凋亡，從而減弱成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子對(duì)前列腺組織的增生作用[32]。而B(niǎo)oNT/A對(duì)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的抑制作用可能與c-Jun氨基端激酶磷酸化水平升高有關(guān)[33]。

3 BoNT/A在前列腺炎中的應(yīng)用

前列腺炎是一種常見(jiàn)的前列腺疾病，主要癥狀為尿道刺激癥狀和慢性盆腔疼痛。前列腺炎分為4型：Ⅰ型前列腺炎為急性細(xì)菌性前列腺炎，Ⅱ型前列腺炎為慢性細(xì)菌性前列腺炎，Ⅲ型前列腺炎為慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征，Ⅳ型前列腺炎為無(wú)癥狀性前列腺炎。BoNT/A對(duì)慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征具有較好的療效。

3.1抑制前列腺平滑肌收縮 部分前列腺炎患者抗菌、抗炎藥物治療效果不佳。臨床上已將α受體阻滯劑用于前列腺炎的治療，通過(guò)松弛前列腺等部位的平滑肌緩解前列腺內(nèi)尿液反流，減輕炎癥癥狀。Maria等[34]首次應(yīng)用BoNT/A注射治療慢性前列腺炎發(fā)現(xiàn)，BoNT/A的作用主要為抑制前列腺平滑肌收縮。在犬前列腺注射200 U BoNT/A后，其前列腺基質(zhì)組織平滑肌收縮水平顯著降低，同時(shí)不影響前列腺的松弛反應(yīng)[35]。

3.2抑制神經(jīng)肽釋放 Wang等[36]建立Wistar大鼠慢性單關(guān)節(jié)炎模型，經(jīng)BoNT/A治療后發(fā)現(xiàn)，大鼠軟骨退變和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)均減輕，提示BoNT/A在抗神經(jīng)性炎癥治療中發(fā)揮重要作用，其原因可能為注射BoNT/A可抑制傷害性神經(jīng)肽的釋放，從而起鎮(zhèn)痛作用。一項(xiàng)雙盲研究將60例慢性前列腺炎患者隨機(jī)分為BoNT/A治療組和安慰劑組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與安慰劑組相比，BoNT/A治療組患者的排尿障礙顯著改善，且治療后的1、3、6個(gè)月，疼痛亞量表評(píng)分較基線分別降低64.76%、75.63%和79.97%，視覺(jué)模擬評(píng)分分別降低62.3%、72.4%和82.1%，同時(shí)慢性前列腺炎癥狀評(píng)分、美國(guó)泌尿外科學(xué)會(huì)評(píng)分、晝尿頻率、夜尿頻率均較基線值顯著降低[9]。另一項(xiàng)無(wú)對(duì)照、隨機(jī)試驗(yàn)比較了63例慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征男性患者經(jīng)尿道和經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)下注射BoNT/A的療效，結(jié)果顯示，治療6個(gè)月后，患者的最大尿流量均顯著改善，其中28例經(jīng)尿道注射BoNT/A的患者生活質(zhì)量和疼痛均有所改善，35例經(jīng)直腸超聲引導(dǎo)下注射BoNT/A的患者慢性前列腺炎癥狀指數(shù)顯著降低，但疼痛改善不明顯[37]。有學(xué)者對(duì)13例慢性盆腔疼痛綜合征患者進(jìn)行會(huì)陰注射BoNT/A治療，結(jié)果顯示均未出現(xiàn)不良反應(yīng)和并發(fā)癥，且緩解疼痛效果顯著[38]。對(duì)于成年男性Ⅲ型非細(xì)菌型慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛綜合征患者給予BoNT/A治療后，前列腺疼痛顯著減輕，且BoNT/A可有效阻斷疼痛感受在盆底功能障礙中的傳導(dǎo)9～12個(gè)月[39]。BoNT/A在改善前列腺炎患者疼痛方面效果顯著，同時(shí)對(duì)于炎癥的緩解也至關(guān)重要。

3.3調(diào)控環(huán)加氧酶2(cyclo-oxygenase-2，COX-2)的表達(dá) 有學(xué)者通過(guò)注射辣椒素建立非細(xì)菌型前列腺炎大鼠模型發(fā)現(xiàn)，其COX-2水平升高，而注射BoNT/A的大鼠COX-2水平顯著降低；BoNT/A預(yù)處理可減少辣椒素引起的疼痛行為和炎癥反應(yīng)，且呈劑量依賴性，注射BoNT/A可有效改善大鼠的前列腺炎癥狀[40]。COX-2與許多涉及組織炎癥和疼痛的病理生理過(guò)程有關(guān)，并可誘導(dǎo)前列腺素合成，尤其是前列腺素E2的合成[41]。有實(shí)驗(yàn)證明，BoNT/A可顯著降低小鼠的前列腺素E2水平[42]。一項(xiàng)關(guān)于大鼠關(guān)節(jié)炎疼痛的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BoNT/A可抑制重要炎癥介質(zhì)(腫瘤壞死因子-α)的釋放，通過(guò)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥而減輕疼痛[43]。但BoNT/A是否直接調(diào)控COX-2的表達(dá)以及是否參與調(diào)控其他炎癥分子的表達(dá)均還需進(jìn)一步研究。

4 BoNT/A在前列腺癌中的應(yīng)用

4.1抑制其他癌細(xì)胞的作用 BoNT/A能夠抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，包括乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常乳腺細(xì)胞MCF10A相比，BoNT/A對(duì)乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性更強(qiáng)，其可誘導(dǎo)T47D乳腺癌細(xì)胞系caspase-3和caspase-7依賴性死亡[44]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在胃的迷走神經(jīng)注射BoNT/A可顯著降低腫瘤的發(fā)生率和延緩腫瘤進(jìn)展。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BoNT/A對(duì)胃癌細(xì)胞BGC-823和MGC-803增殖均有抑制作用，且增加劑量和作用時(shí)間其抑制作用更顯著[45]。

4.2促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡 在原位前列腺腫瘤的瘤體內(nèi)注射BoNT/A后，腫瘤體積縮小，但這種效果維持不超過(guò)8個(gè)月，且僅局限于晚期前列腺癌[46]，可能與BoNT/A對(duì)前列腺癌細(xì)胞的表觀遺傳修飾有關(guān)。另外，BoNT/A可在一定程度上促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。體內(nèi)和體外試驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)，BoNT/A可降低人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP的增殖并促進(jìn)其凋亡，但對(duì)激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞系PC-3則無(wú)顯著影響；LNCaP細(xì)胞和PC-3細(xì)胞均表達(dá)BoNT/A的蛋白受體SV2，但LNCaP中的SV2數(shù)量約為PC-3的4倍，可能與BoNT/A進(jìn)入細(xì)胞的量有關(guān)[47]。研究發(fā)現(xiàn)，在BoNT/A處理后96 h，LNCaP細(xì)胞生長(zhǎng)減少了20%，PC-3細(xì)胞生長(zhǎng)減少了25%，且在LNCaP和PC-3細(xì)胞中檢測(cè)到SV2，提示BoNT/A可能通過(guò)SV2受體進(jìn)入前列腺癌細(xì)胞，因此SV2作為BoNT/A受體可能成為一個(gè)抗腫瘤靶點(diǎn)；另外，BoNT/A誘導(dǎo)的細(xì)胞溶質(zhì)型磷脂酶A2亞型磷脂酶A2-α磷酸化形式的增加可能是抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的一種機(jī)制[48]。BoNT/A對(duì)前列腺癌細(xì)胞增殖具有抑制作用，隨著藥物濃度的增加，前列腺癌細(xì)胞DU145在劃痕實(shí)驗(yàn)中的遷移能力明顯受到抑制，經(jīng)BoNT/A處理后DU145中的p53表達(dá)水平顯著升高[49]，因此BoNT/A可能是潛在的抗癌候選藥物。

4.3神經(jīng)支配 神經(jīng)支配是前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，雙側(cè)去神經(jīng)支配可降低小鼠腫瘤的發(fā)生率和減小腫瘤體積；在人前列腺單側(cè)注射BoNT/A后，癌細(xì)胞凋亡顯著增加[50]。人的前列腺受自主神經(jīng)系統(tǒng)支配，M受體定位于前列腺，M3受體可促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的增殖[51]。經(jīng)BoNT/A處理后，乙酰膽堿受體M3的轉(zhuǎn)錄水平降低[52]，提示BoNT/A可能通過(guò)去神經(jīng)作用控制前列腺癌的進(jìn)展。

5 小 結(jié)

注射BoNT/A治療前列腺疾病(BPH、前列腺炎等)具有一定的臨床療效。且對(duì)于無(wú)法手術(shù)、不能忍受長(zhǎng)期服藥或經(jīng)手術(shù)藥物療法癥狀無(wú)顯著改善的患者，注射BoNT/A治療是一個(gè)很好的選擇。BoNT/A可通過(guò)促進(jìn)前列腺增生組織細(xì)胞凋亡、抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及鎮(zhèn)痛而發(fā)揮作用。但BoNT/A對(duì)于前列腺疾病甚至泌尿外科疾病是否具有更顯著的療效，還需進(jìn)行更多的臨床探索，包括利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行多種肉毒毒素蛋白的融合和突變等。未來(lái)繼續(xù)深入研究BoNT/A治療前列腺疾病的機(jī)制不僅可優(yōu)化前列腺疾病的治療，為前列腺癌治療提供新思路和方法，還可擴(kuò)大臨床應(yīng)用范圍，拓展更多的新型治療藥物。