脈沖激光對誘發型2 型糖尿病大鼠神經病理性疼痛的影響研究

胡國花，蘭 娜

（西安市西電集團醫院麻醉科，西安710077）

0 引言

糖尿病的發病率近年來呈現逐年遞增的趨勢。我國是全球糖尿病第一大國，糖尿病患者占我國總人口的接近10%，而這其中有90%以上被確診為2型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）[1-2]。T2D 可引起機體諸多并發癥，包括心血管疾病、腎病、視網膜病變、神經病變及潰瘍等，這些并發癥也是T2D 具有高致殘率和致死率的主要原因。神經病理性疼痛分為周圍性疼痛和中樞性疼痛2 類，是T2D 最主要的并發癥之一，發病率占T2D 總人數的近50%[3]。糖尿病大多累及周圍神經，以肢體遠端受累為主的對稱性周圍神經病理性疼痛為其主要的表現形式[4]，臨床特點為對于疼痛或非疼痛刺激敏感性增加，體現為自發和觸發痛、痛覺過敏、痛覺超敏和異常性疼痛[5-6]。目前臨床的主要治療藥物包括鎮痛類、抗抑郁和焦慮類、抗炎類及神經營養類，但是由于這些藥物的毒副作用和部分有效性限制，亟待開發更多有效、經濟且安全的治療方法[7-8]。激光器的成功研發使激光在生物醫學領域的研究在近年來受到了越來越廣泛的關注，特別是低強度脈沖激光，憑借其溫和、安全、經濟等優勢，在多種疾病的臨床治療（包括軟組織損傷和骨創傷修復、抗炎癥及抗自由基損傷等[9-10]）中得到了廣泛的應用。

近年來，低強度脈沖激光的生物學效應受到了科研人員和臨床工作者的廣泛關注。諸多研究證實，低強度脈沖激光在皮膚損傷修復、骨折愈合、骨關節炎治療等方面具有積極的療效[11-12]。同時學者們通過動物和臨床研究均揭示，低強度脈沖激光具有緩解慢性疼痛的功效[9，13]。雖然激光所產生的積極的生物學效應的潛在機制尚未明確，但是學者們推測激光對于機體的影響是其誘發的熱效應、機械效應、光化學效應、電磁效應等累積疊加的效果[10]。但是，低強度脈沖激光是否能夠顯著緩解糖尿病誘發的神經病理性疼痛，國內外鮮有研究報道。而研究激光療法對于發生率更高的T2D 所誘發的神經病理性疼痛的作用效果，則更具廣泛的臨床應用價值。本研究通過構建誘發型T2D 大鼠模型，系統地探究低強度脈沖激光對于T2D 所誘發的神經病理性疼痛的作用效果。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑和儀器

清潔級SD 雄性大鼠，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），購自美國Sigma 公司；便攜式血糖分析儀，購自美國Lifescan公司；低強度激光發生系統，購自瑞典Irradia 公司；Von Frey 纖維絲，購自美國Stoelting 公司；熱痛敏刺激和測量系統，購自意大利Commat 公司；cDNA 反轉錄試劑盒，購自北京天根生物技術公司；Maxima SYBR Green qPCR 試劑盒，購自美國Thermo 公司；總RNA 提取試劑Trizol，購自美國Invitrogen 公司。

1.2 實驗設計與分組

實驗動物飼養于溫度（23±1）℃、相對濕度（55±5）%、晝夜明暗周期12 h/12 h 的實驗室環境中。將3月齡的SD 大鼠使用完全隨機分組法分為空白對照組（Control 組）、T2D 組和T2D 激光治療組（T2D+laser組）3 組，每組10 只。Control 組大鼠以普通飼料喂養，T2D 組和T2D+laser 組大鼠以高脂高糖飼料（包含10%豬油、10%蔗糖、2%膽固醇、0.5%膽酸鈉、5%蛋黃粉）喂養，大鼠全部自由飲水。高脂高糖飼料喂養4 周后，對T2D 組和T2D+laser 組大鼠行腹腔STZ注射（質量濃度35 mg/kg），Control 組大鼠行等劑量的檸檬酸緩沖液注射。STZ 注射后繼續高脂高糖喂養4 周。隨后，使用血糖儀通過尾靜脈取血測量各組大鼠清晨的隨機血糖值，血糖值高于16.7 mmol/L 并表現出多飲、多食、多尿的“三高”癥狀的大鼠，被認定為符合T2D 標準，納入本實驗研究。最終所有大鼠均納入研究。T2D+laser 組大鼠施加低強度脈沖激光治療8 周，每天治療3 次，每次50 s；Control 組和T2D 組的大鼠予以假暴露干預。

1.3 脈沖激光裝置

本研究所用的低強度激光裝置為脈沖工作模式，采用單極性電極刺激方式。輸出的激光波長為830 nm，激光裝置的峰值工作功率為20 W，波形的脈沖寬度為200 ns，頻率為700 Hz，平均輸出功率為60 mW，功率密度為60 mW/0.38 cm2，激光的暴露時間為50 s，產生的激光能量為3 J。

1.4 機械痛閾值測定

對3 組大鼠分別在實驗的第0、2、4、6 和8 周實施足底機械痛閾值的測定。具體方法：測量前將實驗大鼠放置于金屬網中，上方設有透明樹脂玻璃罩，令其充分適應30 min。待大鼠安靜后，使用Von Frey 纖維絲刺激大鼠后足中央，刺激過程中或移開纖維絲的瞬間，大鼠出現明顯的抬足、躲避、舔腳等反應，將此次測量記為陽性，并記錄動作發生時間。每一標號的纖維絲對每側足底刺激5 次（雙側10 次），如出現5 次以上陽性反應，則記錄該纖維絲力度為被采集指標。如果發現實驗動物出現5 次不抬腿的情況，則更換更高刻度的纖維絲。

1.5 熱痛閾值測定

對3 組大鼠分別在實驗的第0、2、4、6 和8 周實施足底熱痛閾值的測定。具體方法：測量前，將實驗大鼠置于獨立的有機玻璃籠中，令其充分適應30 min。使用熱輻射測痛儀對大鼠足底中部行熱光束照射，大鼠因無法耐受熱痛出現抬足反應，此時光束會自動切斷并自動記錄反應時間。每只大鼠的每側足底共刺激5 次（雙側共10 次），每次間隔10 min，記錄10次測量值并取其平均值。

1.6 脊髓細胞因子檢測

8 周后，應用過量戊巴比妥鈉溶液對各組大鼠進行腹腔注射處死。通過RNA 提取試劑盒提取腰段脊髓L5 背角總RNA，以2 μg RNA 為上樣量，按照試劑盒說明書的步驟在20 μL 反應體系中對RNA進行逆轉錄反應生成cDNA。使用Bio-Rad CFX96熒光定量PCR 儀對所選目標基因進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增，引物序列詳見表1。PCR 的反應體系：cDNA 模板1.6 μL，上、下引物（濃度為10 μmol/L）各0.8 μL，SYBR 嵌合熒光試劑10 μL，最后使用去離子水將反應體系補充至20 μL。具體反應條件：95 ℃變性處理3 min，95、60 ℃各30 s，循環40 次后，進行55 ℃退火處理15 s。每種基因設置4 個復孔，使用2-ΔΔCT法對白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）和神經生長因子（NGF）的相對表達量進行半定量分析。

表1 本研究實時PCR 檢測中所使用的引物序列

1.7 統計學處理

本實驗涉及的全部實驗數據均使用均值±標準差（±s）表示，使用SPSS 22.0 軟件進行統計學分析。3 組大鼠各實驗參數的統計學差異均使用單因素方差分析。如果單因素方差分析發現3 組數據間存在統計差異，使用Benferoni 多重檢驗法對3 組之間的數據進行兩兩比較，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 低強度脈沖激光治療未改變T2D 大鼠的血糖值

各組大鼠在實驗的第0、2、4、6、8 周的隨機血糖值比較結果如圖1 所示。T2D 組大鼠的隨機血糖值在實驗的第0、2、4、6、8 周均顯著高于Control 組大鼠（P＜0.001），而T2D＋laser 組大鼠的隨機血糖值也同樣在第0、2、4、6、8 周均顯著高于Control 組大鼠（P＜0.001），但是T2D 組與T2D＋laser 組大鼠之間的血糖值在實驗的各時間點均無統計學差異（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠在不同時間的隨機血糖值比較結果

2.2 低強度脈沖激光治療顯著提升T2D 大鼠的足底機械痛閾值

各組大鼠在實驗的第0、2、4、6、8 周的足底機械痛閾值比較結果如圖2 所示。T2D 組大鼠的足底機械痛閾值在實驗的第0、2、4、6、8 周均顯著低于Control組大鼠（P＜0.001），T2D＋laser 組大鼠的足底機械痛閾值在第0 周顯著低于Control 組大鼠（P＜0.001），但與T2D 組大鼠比較無統計學差異（P＞0.05）。T2D＋laser組大鼠的足底機械痛閾值在第2、4、6、8 周均顯著高于T2D 組大鼠（P＜0.01），在第2、4、6 周顯著低于Control 組大鼠（P＜0.05），但在第8 周與Control 組大鼠比較無統計學差異（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠在不同時間的足底機械痛閾值比較結果

2.3 低強度脈沖激光治療顯著提升T2D 大鼠的足底熱痛閾值

各組大鼠在實驗的第0、2、4、6、8 周的足底熱痛閾值比較結果如圖3 所示。與Control 組大鼠相比，T2D 組大鼠足底熱痛閾值在第0、2、4、6、8 周均顯著降低（P＜0.001），而T2D＋laser 組大鼠足底熱痛閾值在第0、2、4、6 周也顯著降低（P＜0.05），但在第8 周無明顯差異（P＞0.05）。與T2D 組大鼠相比，T2D＋laser 組大鼠足底熱痛閾值在第0 周無明顯差異（P＞0.05），但在第2、4、6、8 周均顯著升高（P＜0.01）。

圖3 各組大鼠在不同時間的足底熱痛閾值比較結果

2.4 低強度脈沖激光降低T2D 大鼠脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6 表達水平并提升NGF 表達水平

各組大鼠8 周后的脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6 和NGF 表達結果如圖4 所示。T2D 組大鼠脊髓IL-1β、TNF-α 和IL-6 的基因表達水平顯著高于Control 組大鼠（P＜0.001），脊髓NGF 的基因表達水平顯著低于Control 組大鼠（P＜0.01）。而T2D＋laser 組大鼠脊髓IL-1β、TNF-α 和IL-6 的基因表達水平顯著低于T2D 組大鼠（P＜0.01），其脊髓NGF 的基因表達水平顯著高于T2D 組大鼠（P＜0.05）。但是T2D＋laser 組與Control 組大鼠脊髓IL-1β、TNF-α、IL-6 和NGF基因表達水平無統計學差異（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠8 周后脊髓重要基因表達結果

3 討論

T2D 所誘發的神經病理性疼痛一直是糖尿病并發癥臨床治療的棘手問題，嚴重危害了患者的生理和心理健康[13]。對于T2D 的研究，有諸多的動物模型可供選擇，這其中包括自發型T2D 模型和誘發型T2D 模型[14]。自發型T2D 模型主要依托基因修飾鼠的途徑，而誘發型模型主要通過高脂高糖飲食協同注射STZ 構建。自發型T2D 模型通常需要人為地修改動物體內的特定基因表達，從而達到模擬T2D 臨床特征的效果，但其構建成本較高、周期長，且難以避免所改變的基因對于疾病本身的干擾因素。但是無論是自發型T2D 動物還是誘發型T2D 動物，低強度脈沖激光對于其神經病理性疼痛的作用效果國內外尚鮮有研究報道。本研究使用STZ 注射聯合高脂高糖膳食方法構建誘發型T2D 模型，系統探究了低強度脈沖激光對于誘發型T2D 所引起的神經病理性疼痛的影響。該模型是目前研究T2D 的經典模型之一，也是較為理想的能夠模擬臨床T2D 特征的動物模型。

臨床上糖尿病神經病理性疼痛最重要的表現是痛覺過敏和超敏，而通過行為學的足底機械痛閾值和熱痛閾值檢測，能夠很好地反映T2D 大鼠對于外界刺激的疼痛忍受能力[15]。本研究發現，小劑量的單次STZ 注射協同高脂高糖飲食所誘發的T2D 在實驗的各時間點（第0、2、4、6、8 周）均表現出明顯的足底機械痛閾值和熱痛閾值的降低，這一結果也表明T2D 模型表現出顯著的神經病理性疼痛的特征，提示T2D 神經病理性疼痛模型構建成功。更重要的是，本研究發現低強度的脈沖激光治療在短時間內（2 周）對T2D 誘發的神經病理性疼痛即可產生積極的治療效果，且這種積極的治療效果能夠在治療的全程得以維持，并在第8 周基本達到正常大鼠的水平（T2D＋laser 組在第8 周與Control 組無統計學差異）。本文研究結果提示，低強度脈沖激光療法對于緩解T2D 神經病理性疼痛癥狀具有積極的效果。

同時，大量研究揭示，糖尿病神經病理性疼痛與機體的炎性反應密切相關，諸多炎性因子介導了糖尿病神經病理性疼痛的發生與發展，而調控炎性因子的表達也被認為是開發抗糖尿病神經病理性疼痛新的作用靶點[16-17]。大量證據表明，促炎性因子包括IL-1β、TNF-α 和IL-6 表達在糖尿病機體的脊髓和背根神經節中被誘發，可以導致神經痛敏反應[18]。在本研究中，同樣發現了T2D 大鼠脊髓中的IL-1β、TNF-α 和IL-6 表達水平顯著高于正常大鼠，這也與先前關于T2D 的動物和臨床研究結果保持一致[19]。研究結果還發現經過8 周的低強度脈沖激光治療后，T2D 大鼠脊髓中的促炎性因子IL-1β、TNF-α 和IL-6 的表達水平均顯著降低，這表明激光療法對于T2D神經病理性疼痛的改善效應與其抗炎性反應有關。

在T2D 患者機體中，神經再生能力降低，而作為維持神經元存活和生長發育的關鍵性細胞因子——NGF 的表達水平降低參與T2D 神經病理性疼痛病變的發生與進展[20]。研究發現，T2D 患者血液和脊髓中NGF 的表達水平均顯著降低[21]，而通過外源性的注射，NGF 能夠顯著緩解T2D 神經病理性疼痛癥狀[22]。本研究發現，高脂高糖聯合STZ 注射誘發的T2D 大鼠脊髓中的NGF 表達水平顯著低于Control 組，這也與先前的臨床研究結果保持一致[22]。而8 周的低強度脈沖激光治療顯著提高了T2D 大鼠脊髓NGF的表達水平，這提示激光療法對于神經再生具有潛在的積極促進作用。

綜上所述，本研究證實了8 周的低強度脈沖激光治療對于STZ 注射聯合高脂高糖膳食誘發的T2D大鼠的神經病理性疼痛癥狀具有明顯的改善作用，而該效應與激光對于促炎性因子的抑制和對NGF的促進有關。本研究揭示了低強度脈沖激光療法憑借其溫和、經濟、安全等特性有望成為臨床治療T2D神經病理性疼痛的可行方法。雖然本研究明確了低強度脈沖激光對于T2D 神經病理性疼痛的積極治療效果，但是尚缺乏激光對于T2D 神經病理性疼痛分子信號機制的進一步深入探討。在后續的研究中，將以促炎性因子相關的調控通路為切入點，結合基因測序、模式動物等手段，進一步明確低強度脈沖激光改善T2D 神經病理性疼痛的分子機制。