C型凝集素識別受體2調控動脈粥樣硬化平滑肌細胞增殖和表型轉化的機制研究

徐玉順 鄭 丹 宋 偉

動脈粥樣硬化(AS)是多數心血管疾病如心肌梗死、心絞痛、心力衰竭的主要致病因素，其主要病理過程是動脈內膜形成包含脂質、細胞、碎片和瘢痕組織的不穩定斑塊[1～3]。平滑肌細胞(SMA)位于血管內側層，正常生理條件下主要負責動脈的收縮和細胞外基質的產生，而在AS過程中，SMA由高表達平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin, α-SMA)的收縮型細胞轉變為高表達骨橋蛋白(osteopontin， OPN)的增殖型細胞，同時高表達細胞增殖相關蛋白增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen， PCNA)，促進細胞向斑塊內增殖遷移，加速斑塊的形成，而其中的分子調控機制尚未明確。C型凝集素識別受體2(Dectin-2)是C型凝集素受體的一員[4]。有研究發現Dectin-2高表達于免疫細胞中，在多種真菌感染的免疫炎性反應中起到關鍵的調控作用[5]。而髓系缺失Dectin-2并不影響AS的病理進程[6]。本研究旨在探究SMA中Dectin-2在AS中的作用及其分子機制。

材料與方法

1.材料：(1)細胞株：原代人主動脈平滑肌細胞(批號：CC-2571)購自美國LONZA公司。(2)動物：6只Apoe-/-小鼠和6只C57BL/6(清潔級，6～8周齡，體質量20～25g，雄鼠)購買并飼養于浙江省醫學科學院[使用許可：SYXK(浙)2019-0011]。飼養環境為清潔級，飼養條件：溫度20±2℃，濕度50%±2%，標準光照12h /黑暗12h節律，自由飲水。C57BL/6采用普通飼料喂養，Apoe-/-采用高脂飼料喂養。(3)主要試劑：氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)(批號：1875610)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；XTDMZYYH-1動脈粥樣硬化模型飼料(批號：11984)購自江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司；細胞增殖檢測試劑盒(批號：6548)購自西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司；Edu細胞增殖試劑盒(批號：198421)購自上海碧云天生物技術有限公司；一步法RT-PCR試劑盒(批號：26513)購自艾美捷科技有限公司； Dectin-2、α-SMA、OPN、PCNA RT-PCR引物(批號：516118)均購自鉑尚生物技術(上海)有限公司； p-STAT3兔單抗(批號：ab1651)、STAT3兔單抗(批號：ab1664)、p-JAK兔單抗(批號：ab36565)、JAK兔單抗(批號：ab81384)、Dectin-2兔單抗(批號：ab3626)、SMA鼠單抗(批號：32165)均購自艾博抗(上海)貿易有限公司。原代人主動脈平滑肌細胞培養基SmGM-2 (批號：CC-3182) 購自美國LONZA公司。Dectin-2敲降病毒和對照病毒(批號：1984)購自漢恒生物科技(上海)有限公司。

2.實驗動物及分組：小鼠分為兩組，即對照組和動脈粥樣硬化組，每組各6只。對照組C57BL/6小鼠喂食普通飼料，動脈粥樣硬化組Apoe-/-小鼠飼喂高糖高脂飼料。4個月后，取小鼠主動脈組織，清除周圍結締組織后，利用0.9%氯化鈉溶液清洗干凈，取部分組織用于RNA提取，剩余組織利用多聚甲醛固定后制成石蠟切片。

3.斑塊組織Dectin-2免疫熒光染色：將上述兩組小鼠AS斑塊石蠟切片取出后，放于60℃烘箱中烘1h，之后通過二甲苯-乙醇進行脫蠟進水，利用檸檬酸鈉抗原修復液進行抗原修復，0.5% Triton破膜15 min，利用山羊血清封閉，之后加入一抗孵育過夜(抗體稀釋比：Dectin-2兔單抗1∶200；SMA鼠單抗1∶200)。第2天孵育熒光二抗，最后利用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗熒光淬滅劑進行封片，利用倒置熒光顯微鏡進行拍照。

4.細胞培養:原代人主動脈平滑肌細胞利用專門的SmGM-2培養基培養，細胞密度達到80%時進行傳代。細胞實驗分為兩組，分別為對照組和敲降組，細胞鋪板24h后，對照組加入對照病毒，敲降組加入Dectin-2敲降病毒。同時在培養基中加入ox-LDL刺激。48h后檢測細胞增殖率或者提取蛋白、RNA進行后續實驗。

5.細胞增殖率檢測:SMA細胞鋪板于96孔板中24h，經上述步驟處理后，按細胞增殖檢測試劑盒說明書操作，在每孔中加入細胞活力檢測試劑，孵育培養2h后取出，檢測溶液的吸光度值。細胞增殖率計算公式為：增殖率=(敲降后吸光度值-鋪板24h吸光度值)/鋪板24h吸光度值×100%。每組設置6個復孔。

6.Edu細胞增殖水平檢測：將平滑肌細胞鋪板于細胞爬片上，經上述步驟處理后，按照Edu細胞增殖試劑盒說明書操作，最后用含DAPI的抗熒光淬滅劑進行封片，利用倒置熒光顯微鏡進行拍照。

7.組織或細胞中Dectin-2、OPN、PCNA、α-SMA mRNA水平檢測：取上述小鼠動脈粥樣硬化斑塊組織，或者上述兩組細胞后，利用Trizol裂解組織或者細胞RNA，通過氯仿-異丙醇分離純化出RNA，利用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，進行RT-PCR反應，一步法反應程序為94℃ 10s；60℃ 50s。計算各組mRNA相對表達量，每組設6個復孔。

8.細胞中p-STAT3、STAT3、p-JAK、JAK水平檢測:兩組細胞經上述處理后，提取總蛋白，經過BCA法檢測蛋白濃度，取20μl蛋白進行蛋白電泳。經過電泳-轉膜-封閉后于4℃孵育一抗過夜，一抗包括p-STAT3兔單抗、STAT3兔單抗、p-JAK兔單抗、JAK兔單抗、內參Actin兔單抗。第2天利用TBST洗去未結合的一抗后室溫孵育辣根過氧化物酶耦連的二抗1h，再次利用TBST洗去未結合的二抗，利用化學掃膜儀進行掃膜分析。

結 果

1.小鼠AS斑塊和正常血管中Dectin-2的表達水平:RT-PCR法結果顯示，與對照組比較，動脈粥樣硬化組AS斑塊中Dectin-2 mRNA相對表達量明顯升高(P=0.000)，同時斑塊組織切片免疫熒光染色結果同樣顯示，與對照組比較，斑塊組織中Dectin-2的表達明顯上調(圖1、圖2)。

圖1 小鼠AS斑塊和正常血管中Dectin-2的表達水平與對照組比較，*P=0.000

圖2 小鼠AS斑塊和正常血管中Dectin-2、α-SMA表達免疫熒光，×200

2.敲降Dectin-2對平滑肌細胞增殖率的影響:CCK8結果顯示，與對照組比較，敲降組平滑肌細胞增殖率明顯偏低(P<0.01，圖3、圖4)。

圖3 CCK8檢測Dectin-2對平滑肌增殖的影響與對照組比較，*P<0.01

圖4 Edu檢測Dectin-2對平滑肌增殖的影響 免疫熒光，×600綠色熒光信號為Edu陽性信號，即為增殖細胞

3.敲降Dectin-2對平滑肌細胞OPN、PCNA、α-SMA mRNA相對表達量的影響:RT-PCR結果顯示，與對照組比較，敲降組OPN、PCNA mRNA相對表達量明顯降低，同時α-SMA mRNA相對表達量明顯升高(P<0.01，圖5)。

圖5 RT-PCR檢測Dectin-2對OPN、PCNA、α-SMA的影響與對照組比較，*P<0.01

4.敲降Dectin-2對p-STAT3、STAT3、p-JAK、JAK表達的影響：與對照組比較，敲降組p-STAT3、p-JAK水平明顯降低(P<0.05)，而總STAT3、JAK水平無明顯變化(圖6)。

圖6 Western blot法檢測p-STAT3、STAT3、p-JAK、JAK表達水平

討 論

本研究發現Dectin-2在AS斑塊中表達顯著上調，抑制Dectin-2表達可以減少ox-LDL誘導的SMA增殖和表型轉化。Dectin-2調控SMA的增殖和表型轉化過程可能是通過促進了STAT3信號活化。

Dectin-2是C型凝集素識別受體家族成員，其他還包括C型凝集素識別受體1(Dectin-1)和C型凝集素識別受體3(Dectin-3)。Dectin-2多肽包含一個胞外C端C型碳水化合物識別域(CRD)，該域連接至跨膜結構域和一個短N端胞質結構域，在對真菌和細菌的天然免疫反應中起著關鍵作用[9]。人類蛋白質數據庫(The Human Protein Atlas)顯示Dectin-2主要表達在巨噬細胞中，而在平滑肌細胞中的表達也是較高的[10]。此前研究發現髓系缺失Dectin-2小鼠并不影響AS斑塊的形成[6]。然而目前Dectin-2在SMA中的作用尚未報道。本研究發現,Dectin-2在AS斑塊中表達明顯上調，提示Dectin-2可能在AS其他的基質細胞中發揮著重要的作用。

在AS發生早期，由于內皮細胞受到損傷，導致內皮細胞分泌的一氧化氮明顯減少，而生理狀態下，一氧化氮是維持SMA處于收縮性狀態的關鍵調控信號。一氧化氮的減少導致SMA由高表達α-SMA的收縮型轉變為高表達OPN的增殖型，促進SMA向內膜層增殖遷移，使得局部形成凸起的斑塊組織。因此探究平滑肌細胞增殖和表型轉化的關鍵調控分子有利于為靶向治療AS提供理論依據[11]。本研究發現,Dectin-2敲降平滑肌細胞收縮型標志物α-SMA表達上調，增殖型標志物OPN表達下調，抑制SMA發生表型轉化。同時平滑肌細胞在發生表型轉化后，細胞增殖相關調控蛋白PCNA的表達明顯上調，促進細胞快速增殖，形成新生內膜[12]。因此筆者也檢測了SMA細胞的增殖標志物PCNA的表達，結果顯示，Dectin-2敲降能夠明顯抑制PCNA的表達，Edu增殖實驗結果也顯示，細胞的增殖能力明顯受到抑制。

JAK/STAT3信號是調節細胞增殖、分化和凋亡的關鍵途徑之一[13]。在各種生長因子和細胞因子，包括血小板衍生的生長因子(PDGF)-BB，血管緊張素Ⅱ或白介素(IL)-6或血管內皮生長因子(VEGF)刺激下， SMC中STAT3可發生磷酸化激活[14]。有研究報道，STAT3蛋白通過與心肌素相互作用調節血管SMA發生表型轉換。表明JAK/STAT3信號在VEGF誘導的SMA細胞表型轉化過程中發揮著重要的作用。而本研究發現敲降Dectin-2后JAK/STAT3的磷酸化水平明顯下調。因此，筆者推測Dectin-2通過調控JAK/STAT3的磷酸化活化參與SMA細胞表型轉化的調控。

綜上所述，探究血管平滑肌細胞的增殖和表型轉化的調控機制，對于研究AS的進展有重大意義，本研究發現Dectin-2在AS斑塊中表達上調，對SMA的增殖和表型轉化有重要的調控作用，有望成為靶向治療AS的重要靶點。