miRNA在卵巢早衰顆粒細胞中的研究進展

梁競文 歷 凱 孫麗英 張宇馳 葛鵬玲

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是40歲以前出現的閉經現象，表現為促性腺激素水平下降、月經不調、閉經、不育和圍絕經期綜合征，這種情況可能會對生殖、心理健康和生理健康產生不利影響，其與遺傳因素、病毒感染、自身免疫性疾病、代謝性疾病、醫源性損傷等有關[1，2]。患者出現圍絕經期潮熱盜汗、性欲減退、陰道干澀、失眠、月經減少、稀發，甚則不孕的一系列癥狀，同時伴隨體內雌激素(estrogen，E2)降低，卵泡刺激素(follicule stimulating hormone，FSH)升高，黃體生成素(luteotropic hormone，LH)升高或不變[3]。現代醫學認為POF的相關病因復雜，其發病機制尚不明確，因此探尋該病發病機制是目前研究的重點。在治療方面，激素代替療法(hormone replacement treatment，HRT)是使用較為廣泛的方法，另外還有誘導排卵、卵巢移植或一些聯合治療等，研究表明HRT能預防骨質流失并促進心血管健康，但也有資料表明激素治療中可能存在著一些不良反應，而且可能有增加卵巢癌或其他疾病的風險，這一點仍待考證[4，5]。

在卵巢中卵泡的發育過程是復雜的，它是由原始卵泡經過初級卵泡、次級卵泡及竇卵泡從而進一步發育成熟直至排卵或閉鎖的[6]。由于顆粒細胞(granulosa cells，GCs)的凋亡導致了卵泡閉鎖，因此GCs功能障礙也許會是POF可能的病理特征之一[7]。GCs的作用也引發了研究卵巢相關疾病的重要性，加之miRNA在組織發育和分化過程中起關鍵作用，近年來在探討POF發病機制方面開始有學者聚焦于GCs中miRNA的研究，尋找可以調節POF中GCs功能障礙的miRNA也會為改善POF患者提供新的范例。故本文將對miRNA在POF顆粒細胞中的相關研究進展展開綜述。

一、miRNA在卵巢中的作用

微小RNA(microRNA、miRNA)是一類小型非編碼RNA，改變其表達水平關聯多種病理狀況。它們通過與靶基因3′UTR中的互補序列結合而引起mRNA變性或基因沉默，從而導致基因表達的轉錄抑制。 miRNA還可能控制了生殖內分泌功能，并在卵母細胞成熟和卵泡形成過程中發揮著重要的作用。在類固醇合成中，miRNA還與性腺體細胞、顆粒細胞的功能調節有關。據估計，miRNA可調節70%以上蛋白質編碼基因的翻譯，并參與增殖、分化、凋亡、發育等。在POF潛在的機制中，對蛋白質編碼遺傳因子的研究最為深入，然而，蛋白質編碼基因的編碼外顯子在基因組中的占比非常少，所以基因組的非編碼部分在之前的研究中已被認為是表觀遺傳調控因子，對人體的發育、生理和疾病有至關重要的作用。研究最多的非編碼區類別的典型示例即是miRNA，并且miRNA在卵巢中的研究與探索逐漸增多，高通量與生物信息學等方法已找尋了大量相關的miRNAs，這也揭示了對卵巢基本功能存在的影響。研究揭示了幾種miRNAs在不同物種卵巢中的表達，表明它們可能在卵巢功能中發揮重要作用。miR-23a、miR-27a、miR-22-3p、miR-146a、miR-196a、miR-290-295、miR-423和miR-608等都可能與POF有關。對哺乳動物卵巢中這些miRNA的靶基因進行生物信息學預測、篩選和基因本體論分析也可以確定生物學過程和途徑或分子網絡，包括細胞周期、細胞間信號轉導、細胞生長增殖等。

miRNA在卵巢中作用的研究主要是通過Dicer進行的，Dicer是核糖核酸酶Ⅲ(RNase Ⅲ)家族成員，其能在RNA干擾(RNAi)途徑中發揮作用，將長的雙鏈RNA切割成小RNA，這其中就包括miRNA。當非編碼序列由RNA聚合酶Ⅱ和RNase Ⅲ家族成員Drosha和Dicer處理時，會生成成熟的miRNA。Dicer對于卵母細胞的生長、發育以及對激素信號的響應是必不可少的[8]。Otsuka等[9]研究證明了由于亞型突變導致的Dicer表達減少以及由于卵巢血管生成缺陷和黃體功能不全而導致的不孕等現象。但Dicer作為miRNA生物發生所必需的進化保守的關鍵因素，在女性生殖系統中對GCs等的具體功能尚不清楚。因此，研究Dicer在GCs中的功能也許可以深入了解miRNA在GCs中的作用。

二、顆粒細胞(GCs)與卵巢早衰(POF)

由于POF的機制尚未查清，因此諸多學者致力于研究其機制及可能的延緩方法，其中值得注意的是原始卵泡的耗竭與成熟卵泡的質量,二者提示了POF可能的機制。在卵泡的發育過程中由于卵母細胞的增大，使得周圍的顆粒細胞由原始卵泡中卵母細胞周圍的一層立方狀的顆粒細胞分裂成為多層立體狀細胞層。由于從原始卵泡到成熟卵泡的轉變涉及了GCs的分化和功能轉化，因此，GCs與卵母細胞之間的相互作用對于協調卵母細胞的成熟至關重要。卵母細胞通過一些激活因子的分泌協調GCs的增殖和分化，GCs也為卵母細胞提供營養因子。另外，卵泡的閉鎖主要是由GCs凋亡引起的，GCs還可以通過分泌AMH、FOXL2等調控原始卵泡的激活。因此，抑制顆粒細胞凋亡對于改善POF起著重要作用，在細胞凋亡中，Bcl-2家族與caspase家族的重要性是顯著的，另外FAS通路與TNF通路等都可以介導凋亡，通過檢測相關蛋白的作用對于疾病的研究也有重要的導向作用。

GCs中miRNA的表達可能對卵泡生成和卵巢類固醇生成中涉及的特定基因的表達具有直接的調節作用。研究表明，miRNA參與控制了卵巢類固醇P和E2的釋放[10]。miRNA的表達差異可能解釋了異常的卵泡發育，這也有助于鑒定與該表型有關的途徑。

三、miRNAs在卵巢早衰(POF)中對顆粒細胞(GCs)調控作用的研究

1. miRNAs通過參與GCs激素途徑調控POF:在卵巢中，激素水平的變化可以幫助判定病變情況，包括雌二醇(E2)、黃體激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)等。有研究表明，卵巢中促卵泡激素受體(FSHR)僅在GCs中表達，這對于它們的增殖、生長、功能和分化至關重要。經過FSH處理可以誘導GCs中100多個基因的表達[11，12]。FSH誘導的TGF-β途徑調控已在不同哺乳動物物種的GCs中得到證實，例如人和大鼠等。另一方面，TGF-β信號轉導與叉頭盒L2蛋白(FOXL2)共同調節FSHR，因而影響了卵泡中GCs正常增殖和分化等功能。在卵泡形成過程中，FOXL2與TGF-β超家族成員通過自分泌調節機制發揮了涉及細胞內FSHR轉錄和GCs增殖的雙向調節作用，激活素A和生長分化因子9(growth differentiation factor 9，GDF9)等[13]。另外，在卵泡發育過程中，FSH還增強了GCs細胞中孕酮的產生。Yao等[14]證明了在FSH誘導的大鼠卵巢GCs孕激素分泌過程中，miR-29a和miR-30d顯著下調，這表明它們可能對孕酮的合成有影響。FSH介導的作用除其他信號級聯反應外，還通過3′，5′-單磷酸(cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)/cAMP反應元件結合蛋白途徑完成。由此可見，miRNA可通過與GCs中的FSH途徑相互作用來調節GCs增殖、激素分泌以及分化等。GCs中miRNA的表達也可能對卵泡生成和卵巢類固醇生成中涉及的特定基因的表達具有直接的調節作用。

FOXL2序列和哺乳動物表達的高度保守性提示了在卵巢發育和功能中可能的關鍵作用，FOXL2還參與了炎癥、細胞凋亡、活性氧代謝等。叉頭L2蛋白(FOXL2)在卵巢顆粒細胞中表達并通過轉錄調控靶基因來參與類固醇的發生，研究發現miRNA-133b可以通過靶向STAR和CYP19A1下調FOXL2在顆粒細胞中的表達并且促進了顆粒細胞中雌激素的合成，這為改善POF患者E2激素的下降提供了可能性。

除去促性腺激素、類固醇和其他多種生長因子之間的復雜相互作用外，卵泡的發育還應該受到來自不同細胞的不同信號的調控，GCs中分泌的激素也受到另外一些miRNA的影響，研究表明，miR-144通過抑制環氧合酶2的表達來抑制前列腺素E2，前列腺素E2是重要的卵泡內旁分泌調節劑，在排卵過程中具有特殊作用、miR-375介導促腎上腺皮質激素釋放激素信號通路并抑制卵泡雌二醇合成、miR-96靶向Forkhead box蛋白O1(FOXO1)以誘導人GCs中類固醇的產生[15～17]。miR-378通過靶向豬GCs中的芳香化酶來調節卵巢雌二醇的產生。miR-320通過在卵泡發育過程中靶向E2F1和SF-1來調節類固醇的產生等。這些都在激素途徑上起到相關的作用，后續研究也可以引起對這些miRNA的重視。

2.miRNAs通過顆粒細胞凋亡調控POF：在構建POF模型時，常用化學藥物或放射性處理來建立，如4-乙烯基環己烯雙環氧化物(4-vinylcyclohexene diepoxide,VCD)、環磷酰胺等，其中VCD可以特異性地加速小鼠和大鼠中原始卵泡和初級卵泡的閉鎖，直至耗盡原始卵泡。另外，順鉑作為一種廣泛使用的抗癌藥物，其因過度激活原始卵泡的緣故也常被用來誘導POF模型[18]。實驗發現從骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSC)中收集外泌體可能用于治療順鉑誘導的POF小鼠模型。骨髓間充質干細胞(BMSCs)是具有不同分化潛能的細胞亞群，是干細胞治療領域的研究熱點。干細胞具有自我更新和再生的潛力，干細胞療法也被認為是潛在修復和恢復受損組織正常功能的潛在替代療法，這也為POF的臨床治療提供了一種新方法。間充質干細胞(MSCs)由于其分離，培養和擴增的簡便性，被認為是干細胞治療中最有希望的接種細胞。研究顯示，骨髓間充質干細胞可以修復脊髓、心肌和皮膚損傷[19]。研究表明，骨髓間充質干細胞可以有效恢復大鼠卵巢受損組織的結構和功能，并抑制GCs的凋亡[20]。研究發現，骨髓間充質干細胞可以減慢順鉑誘導的大鼠GCs凋亡。雖然BMSC的工作機制尚不明確，但有證據表明其衍生的外泌體中的miRNA可以影響顆粒細胞的增長，經檢測，miR-664-5p被認為是BMSC衍生的外泌體中的主要RNA，miR-644-5p在BMSC衍生的外泌體中過度表達，并通過靶向p53影響卵巢顆粒細胞的功能，另外，p53、p65和TGF-β之間的轉錄合作還調節了鼠GCs中miRNA-224的轉錄，miR-224的異位表達通過靶向SMAD4刺激TGF-β1誘導了小鼠GCs增殖，目前雖尚未闡明p53在顆粒細胞凋亡中的作用，但這些也都在通路、凋亡相關蛋白和一些相關基因方面為POF的治療提供了新的策略和方向。

近年來隨著化學治療劑的研發和應用，腫瘤患者的存活率不斷提高。但相應地，由化學療法誘發的POF的發生率也在增加[21]。目前，POF的治療仍未得到有效的突破，也尚無徹底的療法可以逆轉化療引起的卵巢結構和功能損害，miR-21作為哺乳動物中最早發現的miRNA之一，與許多細胞的凋亡調控有關，Fiedler等[22]在人絨毛膜促性腺激素處理之前和之后4h在小鼠顆粒細胞中鑒定出13種差異表達的miRNA。進一步的研究表明miR-21可以抑制小鼠排卵性顆粒細胞的凋亡。有研究還通過構建miR-21慢病毒載體轉染MSC并與GCs共同培養，表明miR-21在MSC中的過表達增強了對化療誘導的POF的療效，其修復作用的改善可能與靶向PTEN和PDCD4抑制GCs凋亡有關。這為改善臨床上化療過程中可能引起的卵巢功能問題提供了靶向性依據并指明了方向。

半胱天冬酶級聯是凋亡的重要途徑，caspase-8和caspase-9的激活會啟動細胞凋亡，這會導致凋亡的執行者caspase-3裂解并降解底物多聚ADP-核糖聚合酶[poly(adp-ribose)polymerase，PARP]。研究表明，miR-146a直接靶向IRAK1和TRAF6，通過半胱天冬酶級聯反應促進了卵巢顆粒細胞的凋亡[23]。此外，胱天蛋白酶抑制劑對胱天蛋白酶級聯的抑制作用可以減弱miR-146a對卵巢顆粒細胞凋亡的影響。以上的miRNA對顆粒細胞的凋亡均具有積極的促進作用。這些結果可能對POF的預防或治療有很大用處，當然關于其深入的機制還有待于進一步研究。

四、展 望

miRNA作為一類小型非編碼RNA，廣泛的參與正常狀態和患病狀態[24]。單個miRNA可以抑制數百甚至數千個基因，并且單個基因也可以被多個miRNA調節[25]。現在的研究熱點也開始聚焦于miRNA過表達或沉默及其與相關靶基因或信號通路之間的關系，以期尋找疾病可能的治療手段。

關于POF，未來對miRNA在生理性和功能性排卵中作用的研究也會為不育和其他卵巢疾病提供新的診斷和治療策略，由于顆粒細胞在POF機制中的重要性，系統地鑒定GCs特異的miRNA將有助于研究人員更好地了解與卵巢疾病有關的潛在機制。本文主要描述了miRNA在顆粒細胞中的作用，以及miRNA在GCs中表達的研究，并通過靶向特定分子調節各種信號轉導途徑(例如TGF-β、FSH、激素以及細胞凋亡相關途徑等)直接調節卵巢卵泡的正常發育和功能[26]。許多有關GCs在正常卵巢發育中的功能以及生殖系統疾病，例如多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)和卵巢早衰的知識在很大程度上是通過臨床研究和臨床前動物模型獲得的。因此通過這些模型和實驗找尋大量相關的miRNA進行研究就尤為重要，對miRNA靶向性和作用機制的深入了解也將為正常GCs發育的機制以及這些具有不同GCs表型的疾病的病因和病理生理學研究提供有價值的見解。但盡管如此，調控POF期間miRNA的表達和單個miRNA在顆粒細胞凋亡中的功能的信號通路仍有待闡明。

實際上，miRNA對GCs凋亡的作用應分為兩類：正調控的凋亡miRNA和負調控的凋亡miRNA。一方面，本文已主要說明了幾種miRNA抑制GCs凋亡的機制，無論是通過靶向關鍵蛋白還是激素途徑或影響凋亡信號通路等，都可以起到相應的作用。另一方面，也有miRNA作為了GCs凋亡的啟動子，例如，miR-4110通過靶向SMAD2誘導GCs凋亡，miR-23a和miR-27a通過在Fas配體(FasL)-Fas信號轉導途徑中靶向SMAD5促進人GCs的凋亡等[27，28]。以上的miRNAs是否影響了對于卵巢早衰中GCs的調控作用，又是怎樣進行的，這些還需要開展深入研究。

目前，對于各種miRNA的篩選及其作用機制的探討還要更加深入和全面，作用的靶點也對治療有很重要的意義。文中一些miRNA也許能作為POF的診斷、治療或預后標志物，甚至在POF的治療中具有了可能的治療靶向性，但治療性干預仍需要深入地了解miRNA在調節對卵巢激素的生殖反應中的作用。