lncRNA SBF2-AS1低表達提高食管鱗癌的放射敏感度

查文娟 李曉敏 鐵小偉 陳 瑞 李 皓 劉陽晨

食管癌是一種惡性程度很高的腫瘤，在東亞地區高發[1]。而中國的食管癌發生率居高不下，約占所有食管癌病例的一半[2]。鱗癌和腺癌是食管癌的兩種主要組織學類型，且全球一半以上的食管鱗癌發生在中國[3，4]。而在中國食管癌的發生率位居第6位，病死率位居第5位[5]。中國的食管癌患者主要以食管鱗癌為主，食管腺癌較少。雖然食管癌的治療方法多種，但由于早期診斷困難，被發現時已到中晚期導致患者預后很差，5年總體生存率不足20%[6]。放射治療是食管鱗癌主要的治療方法之一，但是由于存在放療抵抗，影響了放射治療的療效，導致許多食管癌患者放療失敗。但越來越多的研究證實了一種長鏈非編碼RNA(lncRNA)可能是導致惡性腫瘤產生放療抵抗的原因。lncRNA MALAT1在放療耐受的結直腸癌細胞中高表達，并且可以增加細胞活力，MALAT1主要作為ceRNA吸附miR-101-3P來增強結直腸癌細胞的放療抵抗，導致結直腸癌細胞對放射治療不敏感，或許這是許多結直腸癌患者放療失敗的一個可能原因[7]。

lncRNA HOTAIR與乳腺癌細胞的放療敏感度呈負相關，且進一步的研究發現HOTAIR通過與miR-449b-5p結合使得HSPA1A的表達上調，導致乳腺癌細胞放療耐受性的產生[8]。lncRNA MINCR也被發現為是導致鼻咽癌放療抵抗的一個潛在基因，MINCR通過海綿化miR-223，增加ZEB1和激活AKT/PI3K軸來降低鼻咽癌細胞的放射敏感度[9]。同樣地也有許多調控食管鱗癌放療敏感度的lncRNA被發現。LINC00473可以調節microRNA-497-5p 和細胞分裂周期 25A降低食管鱗癌的放療敏感度[10]。lncTUG 1通過降低miR-144-3p水平和調節MET/EGFR/AKT軸來增強ESCC的放射抵抗[11]。SBF2-AS1已被報道可以作為促癌因子在多種腫瘤中發揮作用，但是SBF2-AS1是否是食管鱗癌放療抵抗的潛在的分子尚未被報道。

材料與方法

1.材料：人食管鱗癌細胞TE-13購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；RPMI1640培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；無血清凍存液和10%聚丙烯酰胺凝膠預混液(10%SDS PAGE)購自蘇州新賽美科技公司；TRIzol試劑和lipofectamineRNAiMAX購自美國賽默飛公司，E2F1抗體和actin抗體購自美國CST公司，q-PCR試劑盒和反轉錄試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，胸腺嘧啶核苷酸類似物(thymine nucleotide analogue，EDU)試劑盒購自廣州銳博公司，四甲基偶氮唑藍(methyl thiazol tetrazolium, MTT)試劑盒和蛋白marker購自碧云天生物技術公司。

2.細胞培養與轉染：復蘇食管鱗癌細胞系TE-13和正常細胞HET-1A，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基培養并放在37℃、5%CO2的培養箱中孵育。待細胞長至80%～90%用預冷PBS洗2遍，用胰酶進行消化，待細胞變圓將細胞吹打下來離心，將其分裝在2個培養瓶中。取對數生長期的細胞鋪板于6孔板中，24h后按照LipofectamineRNAiMAX說明將si-SBF2-AS1和si-NC 轉染進TE-13細胞中分為si-SBF2-AS1組和si-NC組，轉染48h后進行后續實驗。

3.RT-PCR檢測：RT-PCR檢測SBF2-AS1的表達水平：用TRIzol試劑按照說明書提取細胞中的總RNA，并檢測濃度和純度；用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，熒光定量PCR進行RT-PCR。以GAPDH為SBF2-AS1的內參基因，SBF2-AS1的相對表達量用2-ΔΔCt計算。反應條件：95℃，預變性5min(1個循壞)，95℃ 10s，60℃ 30s(40個循壞)；相應的引物序列：SBF2-AS1 上游引物：5′-CACGACCCAGAAGGAGTCTAC-3′，下游引物：5′-CCCGGTACCTTCCTGTCATA-3′；GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

4.MTT法檢測：si-SBF2-AS1和si-NC 轉染進TE-13細胞然后分別用0Gy和4Gy的X線照射后將細胞分為si-NC組、si-SBF2-AS1組、IR+si-NC組和IR+si-SBF2-AS1組，收集細胞以每孔5000個鋪到96孔板中，每組設置5個復孔，培養24、48、72和96h后分別在每個孔中加入100μl MTT溶液適當混勻，在37℃培養箱中孵育4h；每孔加入100μl Formazan溶液適當混勻，在培養箱中孵育3h，最后在570nm波長處測吸光度。

5.EDU實驗：si-SBF2-AS1和si-NC 轉染進TE-13細胞然后分別用0Gy和4Gy的X線照射后將細胞分為si-NC組、si-SBF2-AS1組、IR+si-NC組和IR+si-SBF2-AS1組，以每孔1×105個細胞鋪進免疫熒光薄底96孔板中，每組設置3個復孔。每個孔中加入100μl 50nmol/L Edu培養基孵育2h，棄培養基，PBS清洗細胞2次，每次5min。然后加入50μl的細胞固定液室溫孵育30min，棄固定液，接著加入50μl 2mg/ml甘氨酸，脫色搖床孵育5min，棄甘氨酸。再加入100μlPBS脫色搖床清洗5min，使用100μl滲透劑脫色搖床孵育10min，然后加入100μl的1×Apoll?染色反應液進行染色，避光室溫脫色搖床孵育30min，棄反應液。接著加入100μl滲透劑清洗2遍，最后每孔加入100μl 1×Hoechst33342反應液進行DNA染色，避光室溫孵育30min，加PBS清洗2次；最后用熒光顯微鏡放大100倍進行圖像獲取。

6.流式細胞術：取對數生長期的TE-13細胞消化下來鋪進6孔板，將si-SBF2-AS1和si-NC 轉染進TE-13細胞然后分別用0Gy和4Gy的X線照射后將細胞分為si-NC組、si-SBF2-AS1組、IR+si-NC組和IR+si-SBF2-AS1組，每組設置3個復孔。收集細胞(約1×106個)，用預冷PBS清洗2次之后棄去PBS，在每管中加入100μl的binding buffer，輕輕吹打混勻；1000r/min離心5min,避光條件下每管加入0.5ml PI染色，重懸細胞，室溫避光孵育15min后進行流式檢測。

7.Western blot法:取對數生長期的TE-13細胞消化下來鋪進6孔板，將si-SBF2-AS1和si-NC 轉染進TE-13細胞然后4Gy的X線照射后將細胞分IR+si-NC組和IR+si-SBF2-AS1組。待細胞長至70%～80%時用預冷PBS清洗2次，在每個孔中加入含有1μl cocktail的RIPA裂解液，并放在冰上裂解20min，之后將細胞刮下來，12000×g4℃離心15min。取上清，按上清液的量加入5×SDS使其稀釋成1×SDS，95℃煮5min，用BCA蛋白測濃度。取40μg的蛋白用配好10%聚丙烯酰胺凝膠預混液電泳，轉膜后用2%脫脂奶粉室溫孵育2h，一抗4℃搖床孵育過夜。TBST搖床清洗3次，每次5min，二抗室溫孵育1h，TBST清洗3次，每次5min，采用ECL化學發光試劑盒顯影。

結 果

1.SBF2-AS1在食管鱗癌細胞和食管正常上皮細胞中的表達水平：用RT-PCR檢測人食管鱗癌細胞TE-13和人正常食管上皮細胞HET-1A中SBF2-AS1的表達。TE-13細胞中SBF2-AS1的表達(5.508±0.283)明顯高于HET-1A組(1.000±0.344)，差異有統計學意義(t=4.710，P=0.009)，詳見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測SBF2-AS1在TE-13和HET-1A中的表達

2.TE-13細胞存活：用si-SBF2-AS1和si-NC轉染TE-13細胞，并用0Gy、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy照射，結果顯示，與si-NC組(100%±0.00%、83.00%±4.00%、69.00%±7.00%、58.00%±3.00%、36.00%±6.00%)比較，si-SBF2-AS1組(100.00%±0.00%、55.00%±1.00%、26.00%±5.00%、10.00%±3.00%、4.00%±4.00%)的細胞存活分數顯著降低，差異有統計學意義(t=2.497，P=0.047)，詳見圖2。

圖2 不同放射劑量下TE-13細胞的存活曲線

3.TE-13的A值：與si-NC組比較，IR+si-NC組、si-SBF2-AS1組和IR+si-SBF2-AS1組在48h和72h的A值顯著降低。與IR+si-NC組比較，IR+si-SBF2-AS1組48h和72h的A值顯著降低。與si-SBF2-AS1組比較，IR+si-SBF2-AS1組48h和72h的A值顯著降低，差異有統計學意義，詳見表1。

表1 MTT檢測各組細胞的活力

4.TE-13細胞的增殖能力：與si-NC組比較，IR+si-NC組、si-SBF2-AS1組和IR+si-SBF2-AS1組增殖率顯著降低。與IR+si-NC組比較，IR+si-SBF2-AS1組增殖率顯著降低。與si-SBF2-AS1組比較，IR+si-SBF2-AS1組增殖率顯著降低，差異有統計學意義,詳見圖3和表2。

圖3 EDU檢測各組細胞增殖水平A.si-NC組；B.IR+si-NC組；C.si-SBF2-AS1組；D.IR+si-SBF2-AS1組

表2 干擾SBF2-AS1的表達聯合放療對TE-13細胞增殖率的影響

5.TE-13細胞凋亡：與si-NC組比較，IR+si-NC組、si-SBF2-AS1組和IR+si-SBF2-AS1組的細胞凋亡率顯著升高。與IR+si-NC組比較，IR+si-SBF2-AS1組的細胞凋亡率顯著升高。與si-SBF2-AS1組比較，IR+si-SBF2-AS1組的細胞凋亡率顯著升高，差異有統計學意義，詳見圖4和表3。

圖4 流式細胞術檢測各組細胞凋亡水平A.si-NC組；B.IR+si-NC組；C.si-SBF2-AS1組；D.IR+si-SBF2-AS1組

表3 干擾SBF2-AS1的表達聯合放療對TE-13細胞凋亡的影響

6.干擾SBF2-AS1的表達聯合放療抑制E2F1蛋白的表達：與IR+si-NC組(80.000±3.215)比較，IR+si-SBF2-AS1組(45.000±3.215)E2F1蛋白的表達量顯著下降，差異有統計學意義(t=7.699,P=0.002)，詳見圖5。

圖5 干擾SBF2-AS1的表達聯合放療對E2F1蛋白的影響

討 論

雖然現在食管鱗癌的治療方法有很多種，放療也是食管鱗癌治療的主要手段之一，特別是對于胸中上段的食管鱗癌來說。新輔助放療和術后輔助放療都是食管鱗癌治療的標準方法， 盡管放射療法及各種新型化療藥物的臨床應用提高了治療效果,但患者的生存率仍然較低,其中放療抵抗被認為是導致食管鱗癌治療失敗的原因之一。因此尋找影響食管鱗癌放療療效的基因可能為以后提高放療療效奠定基礎。lncRNA是一種具有200多個核苷酸的非編碼RNA，lncRNA可以從表觀遺傳學、轉錄和轉錄后的角度調節生物體的生理功能。它們參與細胞增殖、分化、染色體重塑、表觀遺傳調控、轉錄和轉錄后調控等多種生物學過程[12,13]。根據其特征和功能，它們可以在多種腫瘤中起著促癌或抑癌因子的作用。隨著lncRNA研究的深入，它們也被發現可以調控化療或者放療的敏感度，這一發現為食管鱗癌的臨床診斷和治療提供了新的思路。lncRNA SBF2-AS1已被發現不僅在多種腫瘤中上調，而且對放療也有影響。Yu等[14]研究發現SBF2-AS1可以通過micoRNA-302a/MBNL3來增強非小細胞肺癌的輻射抗性。

本研究結果顯示，SBF2-AS1在食管鱗癌放療抵抗細胞株中高表達。E2F1是一種轉錄因子，一般參與調節了細胞周期的進程。且有許多研究發現E2F1可以促進多種腫瘤生長如膀胱癌、垂體瘤和喉癌[15～17]。也有研究發現E2F1會影響惡性腫瘤放射治療。研究發現TFAM下調使E2F1下降導致G1期阻滯進而抑制腫瘤細胞的增殖最后導致腫瘤細胞的放射敏感度提高[18]。microRNA-16-5p通過調節細胞周期蛋白D1/E1-pRB-E2F1通路增強前列腺癌細胞的放射敏感度[19]。本研究發現E2F1在食管鱗癌放療抵抗細胞株中高表達。本研究結果顯示SBF2-AS1可以使E2F1表達升高，SBF2-AS1可以促進食管鱗癌放療抵抗細胞增殖，并且促進食管鱗癌放療抵抗細胞中E2F1蛋白和mRNA的表達，由此可推斷SBF2-AS1是通過促進E2F1表達來提高食管鱗癌細胞的放療抵抗的，但關于SBF2-AS1調控E2F1的機制還應進行深入研究。