FLOT2在結直腸癌中的表達及其臨床意義

李一凡 杜冀暉 趙 慧 李啟鳳 方麗珊 周瑜瑾 龔 慧

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是消化系統常見惡性腫瘤之一。據統計，2018年結直腸癌全球發生率為6.1%，居惡性腫瘤第3位，其病死率為9.2%，居惡性腫瘤第2位，總計超過180萬例結直腸癌新增病例和881000例死亡病例，約占所有癌癥死亡病例的1/10[1]。因此，有必要尋找更特異的結直腸癌分子標志物。

脂筏是細胞膜上直徑約為10～200nm的微小區域，富含大量膽固醇、神經鞘磷脂等物質及caveolins(CAVs)、flotillin-1(FLOT1)、flotillin-2(FLOT2)、prohibitin (PHB)、stomatin(EPB72)-like 2(STOML2)等組成性蛋白，參與細胞膜運輸及信號轉導等諸多生理過程。近期研究發現，脂筏蛋白在多種腫瘤中表達上調，提示其在腫瘤發生、發展過程中扮演了一定角色。脂筏蛋白FLOT1在多種惡性腫瘤中表達上調并發揮調控作用[2]。FLOT2最近被確定參與多種惡性腫瘤的發生、發展過程，例如乳腺癌、黑色素瘤、宮頸癌、肺癌、肝癌、腎癌和胃癌，這提示FLOT2可能在惡性腫瘤發生、發展中發揮一定作用[3～10]。然而，FLOT2表達水平與結直腸癌中表達水平、生物學功能和分子調控機制尚待闡明。本研究采用熒光定量PCR和免疫組織化學方法檢測FLOT2在結直腸癌中表達，探討FLOT2表達水平與結直腸癌臨床病理特征及患者生存預后之間的相關性，為進一步實驗研究提供思路。

資料與方法

1.標本資料:收集2013～2014年在廣東醫科大學附屬深圳第六醫院確診為結直腸癌的患者手術切除癌組織及相應癌旁非瘤組織標本，共4對。收集后立即放至液氮中保存。收集2003～2012年結直腸癌患者手術切除的癌組織石蠟切片，共157例，并將這157份標本納入統計分析。上述標本由兩名高級病理醫生在石蠟切片和免疫組化染色后獨立評估。所有結直腸癌患者術前均未接受化療、放療和免疫治療。本研究經廣東醫科大學附屬深圳第六醫院醫學倫理學委員會批準。患者臨床資料詳見表1。

2.主要試劑: 兔抗人FLOT2多克隆抗體購于美國Sigma公司，稀釋濃度為1∶1000，免疫組化SP法試劑盒購于美國Thermo Fisher公司，DAB試劑盒購于北京中山金橋公司。

3.免疫組織化學染色: 所有標本用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋。免疫組化采用SP法，以PBS代替一抗作為陰性對照。樣品經烘烤、脫蠟、水化，用檸檬酸鈉緩沖液進行抗原修復，用3%過氧化氫溶液封閉內源性過氧化氫酶，用血清封閉非特異性表位。在4℃冰箱孵育一抗過夜后，37℃孵箱孵育二抗15min。用二氨基聯苯胺(diaminobenzidine, DAB)顯影后，蘇木精復染、鹽酸乙醇分化后，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，最后用中性樹脂封片。

4.結果判斷標準: FLOT2蛋白主要定位于細胞膜，從顏色為淡黃色至棕黃色。隨機選取10個高倍視野進行計數(×400)，計算陽性細胞百分比，即在10個高倍鏡視野下所有著色的細胞(即表達陽性細胞)與視野下所有細胞的比值。陽性細胞百分比評分的評分標準為:陽性細胞百分比<25%為0分，25%～50%為1分，>50%且≤75%為2分，>75%為3分。染色程度評分標準為：根據細胞染色程度，無染色為0分、淡黃色為1分、黃色為2分、褐色為3分。最終的染色評分為陽性細胞百分比評分×染色程度評分的乘積，即0、1、2、3、4、6、9分，以中位數3作為截斷值(cut-off)，0～3分為低或不表達，>3分為高表達。

表1 結直腸癌患者的臨床病理特征和FLOT2的表達

結 果

1．結直腸癌組織中FLOT2表達水平上調：通過熒光定量PCR檢測4對CRC腫瘤及相應癌旁非腫瘤組織標本中FLOT2的mRNA表達，發現CRC組織中FLOT2 mRNA表達水平上調。患者A、患者B、患者C、患者D的CRC腫瘤組織標本中FLOT2的mRNA相對定量值與相應癌旁非腫瘤組織標本中FLOT2的mRNA表達相對定量值的比值分別是6.00、4.10、5.34、8.05，經Student′sttest檢驗,P<0.05，各患者的癌與癌旁FLOT2表達差異有統計學意義。其中，相對定量值指的是FLOT2 mRNA與內參基因GAPDH mRNA的比值。免疫組織化學結果顯示，FLOT2陽性染色主要定位于細胞膜。FLOT2在4例結直腸癌組織中的表達均為陽性，高于相應癌旁非腫瘤組織(圖1)。

圖1 FLOT2在CRC石蠟組織切片中表達水平上調(×200)病理切片為二氨基聯苯胺(DAB)染色后，蘇木精復染。紅色箭頭指示FLOT2表達陽性細胞

2.FLOT2的表達水平與相應臨床病理參數之間的相關性：免疫組化結果顯示，FLOT2在正常的結直腸組織切片中表達極低，而在低度惡性組(Ⅰ/Ⅱ)中呈弱陽性表達，在高度惡性組(Ⅲ/Ⅳ)中呈強陽性表達(圖2)。根據免疫組化評分將157例結直腸癌標本分為低表達組和高表達組。兩組的對比結果分析顯示FLOT2的表達強度與結直腸癌患者的Dukes分期(P=0.013)、臨床分期(P=0.013)、T分期(P=0.001)、N分期(P=0.021)、M分期(P=0.016)、組織分化(P=0.016)和患者生存預后(P=0.025)顯著相關，而與患者的年齡、性別和腫瘤位置無顯著相關性(表2)。

圖2 免疫組化檢測FLOT2在癌旁非腫瘤組織和結直腸癌組織中的表達(臨床階段Ⅰ～Ⅳ)A、B.FLOT2在癌旁非腫瘤組織表達；C、D.FLOT2在腫瘤臨床分期Ⅰ期結直腸癌組織表達；E、F.FLOT2在腫瘤臨床分期Ⅱ期結直腸癌組織中的表達；G、H.FLOT2在腫瘤臨床分期Ⅲ期結直腸癌組織的表達；I、J.FLOT2在腫瘤臨床分期Ⅳ期結直腸癌組織表達。病理切片為二氨基聯苯胺(DAB)染色后，蘇木精復染

表2 FLOT2的表達水平與結直腸癌臨床病理特征之間的關系[n(%)]

3.FLOT2的表達水平在結直腸癌患者中的預后價值：根據免疫織化評分結果，筆者將157例結直腸癌標本分為低表達組和高表達組，并對FLOT2高表達和低表達的結直腸癌患者進行Kaplan-Meier生存分析。Kaplan-Meier存活曲線顯示FLOT2的表達水平與結直腸癌的總生存率顯著相關，FLOT2高表達病例組的生存時間明顯少于FLOT2低表達病例組，經Log-rank檢驗，兩組之間比較差異有統計學意義(χ2=5.907，P=0.015，圖3)。

圖3 結直腸癌患者FLOT2低表達組和FLOT2高表達組的生存曲線

討 論

配體與相應受體在脂筏區域的動態募集是諸多信號通路激活的關鍵。脂筏為NF-κB、WNT/β-catenin、EGFR (epidermal growth factor receptor)、TCR (T cell antigen receptor)、BCR (B cell antigen receptor)等信號通路的激活提供了分子募集激活平臺。TNFR與TNF-α結合并轉位至脂筏，募集RIP及TRAF2等，形成信號分子復合體，從而激活NF-(B信號通路[11]。研究證實脂筏是IL-1β、LPS和CD3/CD28等介導NF-κB信號通路激活過程中所必需[12～14]。脂筏區域內存在諸多與信號轉導相關蛋白，如GPI錨聯蛋白、G蛋白、G蛋白偶聯受體和激酶等。脂筏和脂筏蛋白在細胞膜上執行正常功能，起到類似于轉化器信號轉導作用，如果某些脂筏蛋白表達增加，意味著轉換器信號增多，過多信號促進腫瘤發生、發展。許多參與癌癥發生、發展、轉移的信號轉導受脂筏調節。腫瘤發生、發展相關脂筏蛋白有多種，如caveolin-1(CAV1)、FLOT1和STOML2等。FLOT1可通過激活NF-κB和β-catenin信號通路發揮促癌作用。近期研究發現脂筏蛋白FLOT2在若干腫瘤中表達增高，提示其也可能有促癌作用。

本實驗發現在結直腸癌組織中FLOT2表達水平顯著增高。FLOT2在低度惡性組(Ⅰ/Ⅱ)中呈弱陽性表達，在高度惡性組(Ⅲ/Ⅳ)中呈強陽性表達。FLOT2的表達強度與結直腸癌患者的Dukes分期、臨床分期、T分期、N分期、M分期、組織分化和生存預后呈顯著相關，而與患者的年齡、性別和腫瘤位置無顯著相關性。Kaplan-Meier存活曲線顯示FLOT2的表達水平與結直腸癌的總生存率顯著相關。

最近研究表明，FLOT2參與調節腫瘤干細胞(如胰腺癌干細胞)特征[15]。筆者發現FLOT2無表達或低表達的結直腸癌組織高分化比例偏高，FLOT2高表達的結直腸癌組織中分化和低分化比例較高，該發現提示FLOT2與腫瘤分化程度密切相關。該發現是否與FLOT2對腫瘤干細胞特征調節有關尚有待研究。FLOT2的表達強度與結直腸癌患者的Dukes分期、臨床分期、生存預后顯著相關，提示結直腸癌FLOT2表達水平有望成為預判結直腸癌患者預后的分子標志物。另外，筆者發現，FLOT2的表達強度與結直腸癌患者的T分期、N分期和M分期顯著相關，FLOT2的表達強度與結直腸癌患者的年齡、性別和腫瘤位置無相關性，這些發現與前期報道一致[16]。筆者發現，FLOT2的高表達水平與結直腸癌的總生存率顯著相關(χ2=5.907，P=0.015)，該結果也與前期報道結果一致[16～18]。

FLOT2高表達可促進結直腸癌的增殖和轉移，但FLOT2在結直腸癌發生、發展過程中的分子機制尚未有明確結論[17]。有研究顯示，與結腸直腸正常細胞比較，轉移性SW620細胞衍生的脂質體中選擇性富集脂質筏和脂質筏相關蛋白(CAV1、FLOT1、FLOT2、PROM1)，提示FLOT2可能與結直腸癌轉移有關[19]。研究表明，抑制FLOT2可以通過調節Akt/FOXO信號轉導抑制乳腺癌細胞的增殖[20]。FLOT2缺乏癥可導致小鼠乳腺癌模型的肺轉移減少[21]。FLOT2可通過與PLCD3相互作用參與鼻咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲[22]。FLOT2促進鼻咽癌(NPC)轉移，是轉化生長因子(transforming growth factor-β, TGF-β)誘導的上皮-間質轉化所必需的[23]。

FLOT2蛋白在結直腸癌中表達增高，其表達水平與結直腸癌臨床分期、TNM分期、病理分化程度和患者總體生存率顯著相關，因此FLOT2有可能成為評估結直腸癌患者預后的新的分子標志物。在未來研究中，FLOT2蛋白在結直腸癌發生、發展過程中的作用和機制仍有待于進一步研究。