應用組織芯片技術對PRDX3與α-SMA的相關性研究

陳遠洋 王志維

組織芯片是將數十個乃至上千個組織樣本整齊地排列在同一張載玻片上而制成的微縮組織切片,具有節省材料、樣本量大、操作性統一、對比性強等優點。由于人體的心血管樣本收集難度較大，采用組織芯片技術能減少制作過程中的樣本損耗[1,2]。

多種心血管疾病會造成冠狀動脈狹窄，隨著狹窄的不斷發展，冠狀動脈內會因血流量不足而導致缺氧，引起氧化應激損傷。氧化應激是指當體內氧化與抗氧化失衡時產生過量氧自由基，例如活性氧(reactive oxygen species, ROS)和反應性氮(reactive nitrogen species, RNS)，而ROS和RNS又會作為損傷因素進一步刺激血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells, VSMCs)的表型轉化和增殖遷徙，因此氧化應激與VSMCs的表型轉化及功能改變密切相關[3,4]。過氧化物酶(peroxiredoxin，PRDX)3是一種在生物體內廣泛表達，能有效清除過氧化物及自由基的抗氧化酶[5]。α-SMA是血管平滑肌細胞表型轉化的主要標志物，成熟的收縮型平滑肌細胞主要表現為收縮能力較強，α-SMA表達較高;而分泌型平滑肌細胞的主要表現為增殖能力較強，α-SMA表達較少[6]。綜上所述，筆者認為：冠狀動脈狹窄引起的氧化應激損傷可能會促進VSMCs由收縮型轉化為分泌型，α-SMA表達減少，PRDX3表達增加，并且兩者具有相關性。

材料與方法

1.人體標本與實驗分組：收集2017年7月～2020年7月于武漢大學人民醫院接受心臟移植患者的冠狀動脈組織標本，按患者是否存在冠狀動脈狹窄分為狹窄組和正常組，其中狹窄組25例，正常組15例。本研究中所有樣本均由冠狀動脈CTA和HE染色證明是否存在冠狀動脈狹窄：納入標準：①年齡>18歲，病史清晰，診斷明確，患者知情同意本研究；②獲取的冠狀動脈樣本結構完整。排除標準：①合并肝臟、腎臟等其他重要器官疾??；②合并惡性腫瘤患者；③合并其他血管疾病。患者在入院后行心臟移植手術，在心臟移植術后取下患者的心臟，分離出左右冠狀動脈組織。標本取出后，用預冷的0.9%氯化鈉溶液漂洗，一部分凍存于液氮中，一部分用4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋用于制作組織芯片。術前所有實驗方案均已告知家屬，并簽署知情同意書，且該部分實驗經武漢大學及武漢大學人民醫院醫學倫理學委員會審批同意。

2.實驗細胞來源：原代血管平滑肌細胞均來源于體質量為150～200g的Sprauge-Dawley大鼠，實驗動物均由湖北省疾控動物中心采購，飼喂于武漢大學人民醫院動物實驗中心。在無菌條件下對大鼠進行麻醉手術獲取其主動脈，在超凈工作臺內將主動脈用PBS清洗后,除去主動脈的內外膜，將其剪碎成均勻小塊，采用貼壁法在培養皿中進行培養。在顯微鏡下觀察血管平滑肌細胞的形態進行鑒別，培養穩定后進行傳代。

3.實驗試劑：PRDX3抗體(北京Bioss生物技術公司)、α-SMA抗體(武漢Servicebio生物技術公司)、β-actin抗體(武漢Servicebio生物技術公司)、抗兔二抗(美國Cell Signaling Technology公司)。

4.Western blot法實驗：按照分組將狹窄組和正常組冠狀動脈處理后，取約50mg組織于1.5ml EP管內，加入含有適量比例的蛋白酶抑制劑(Cocktail、PMSF)的RIPA裂解液，進行研磨后在冰上裂解；將獲取的蛋白樣本于冷凍離心機中以4℃ 12000r/min離心20min，棄去沉淀的組織，收集上清液后在冰上超聲裂解。根據所獲得蛋白樣本的總體積，以適當的比例加入蛋白上樣緩沖液混勻，在100℃金屬浴加熱15min，所得到的蛋白樣本凍存于-80℃冰箱中。電泳時，每孔蛋白上樣量為20μg，以 90V電壓，40mA電流，在10% SDS-PAGE丙烯酰胺凝膠中進行電泳。電泳完成后，在電流200mA，電壓100V條件下進行轉膜1.5h。而后用5%脫脂牛奶在搖床上封閉，一抗4℃孵育過夜。以β-actin為內參，使用羊抗兔熒光二抗顯影，在Odessy熒光掃膜系統上掃膜，并對結果進行半定量分析。

提取大鼠原代血管平滑肌細胞后培養，分別用0、5、10、20ng/ml的血小板衍生生長因子(可刺激VSMCs分裂增殖)處理24h后，棄去培養基后，加入RIPA裂解液，在冰上裂解、離心超聲，加入上樣緩沖液，用金屬浴加熱后于同樣條件下進行Western blot法實驗，并對結果進行分析。

5.免疫組化：各組標本經4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后進行切片制作成含多個樣本組織的組織芯片。將組織芯片置于65℃恒溫烘箱中加熱融蠟2h，然后放入二甲苯溶液中脫去殘留的石蠟，進行常規的水化步驟后用PBS漂洗。用Triton試劑(含2‰的曲拉通的PBS溶液)破膜15min，而后在枸櫞酸緩沖溶液中進行微波加熱修復。自然冷卻后，用3%的過氧化氫消除內源性過氧化物酶，血清常溫封閉1h，一抗4℃孵育過夜。室溫復溫1h，二抗避光孵育1h。用DAB染色液在顯微鏡下顯色，顯色后蘇木精染核，鹽酸乙醇分化，漂洗干凈后進行風干，中性樹脂封片，最后在全自動顯微鏡下觀察拍照。用Image J軟件測量蛋白的陽性率。

6.統計學方法：使用Graghpad 6.01統計學軟件對數據進行統計分析。計量資料的兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。配對資料用Pearson相關系數表示，相關系數r為0.6～1.0為強或極強相關；0.4～0.6為中等相關；0～0.4為弱或極弱或無相關。當1>r>0時表示正相關,當0>r>-1時表示負相關，r=0時表示無相關。

結 果

1.組織芯片中PRDX3、α-SMA的表達及相關性分析：組織芯片的免疫組化染色發現，狹窄組PRDX3表達較高(棕色代表陽性信號)，α-SMA較低(圖1、圖2)；反之正常組α-SMA表達較高，PRDX3表達較低(圖3、圖4)。將兩種蛋白陽性率統計分析后，發現PRDX3與α-SMA之間具有負相關性(由于樣本剔除及損壞，最終采用樣本量為32例，圖5)。

圖1 兩組α-SMA的免疫組化染色A、C為正常組40倍及400倍視野；B、D為狹窄組40倍及400倍視野

圖2 α-SMA免疫組化染色定量結果

圖3 兩組PRDX3的免疫組化染色A、C為正常組40倍及400倍視野；B、D為狹窄組40倍及400倍視野

圖4 PRDX3免疫組化染色定量結果

圖5 組織芯片中PRDX3與α-SMA的相關性兩者呈負相關，r=-0.8，P=0.000

2.Western blot法實驗驗證組織芯片中的PRDX3表達：將兩組組織提取蛋白后進行Western blot法實驗，發現狹窄組的PRDX3蛋白與正常組比較顯著過表達，差異有統計學意義(圖6)。重復實驗后得到相同結果，證明PRDX3表達與冠狀動脈狹窄相關。

圖6 Western blot法實驗的PRDX3表達結果

3.細胞實驗中用PDGF處理VSMCs后的PRDX3表達：在大鼠原代VSMCs培養穩定后，分別加入0、5、10、20ng/ml的血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)進行處理，24h后提取細胞蛋白進行Western blot法實驗。發現隨著在相同時間內隨著PDGF濃度增加，PRDX3的表達量隨之增加(圖7)。說明在VSMCs的增殖過程中，伴隨著氧化應激水平的增加，抗氧化酶PRDX3增加。

圖7 細胞實驗的PRDX3表達

討 論

在心血管疾病的研究中，由于人體心臟血管標本的獲取難度較大，一定程度上限制了心血管研究的發展。組織芯片是生物芯片的一種, 利用組織芯片可對大樣本量的組織標本同時進行形態結構比較，以及基因和蛋白表達的定位檢測, 是對基因芯片和蛋白芯片的重要補充[7]。在傳統免疫組化中,最大的缺點就是多個標本處于不同實驗條件下，造成免疫組化結果出現很大組內差異, 甚至出現假陽性或者假陰性。而運用組織芯片的免疫組化由于實驗條件一致可有效減少實驗誤差，提高染色結果的質量。可以同時對免疫組化染色結果進行平行分析,大大節約抗體和時間。并且可以減少制作切片過程中對組織原材料的損耗[8]。本研究通過組織芯片技術的應用，幫助較高效、快速地獲取實驗數據，有足量的數據支持PRDX3和α-SMA之間的相關性。由于人體組織標本之間存在年齡、性別、發病程度等多種差異，樣本均一性相對較差。為了驗證組織芯片的免疫組化結果，后續又進行了Western blot法實驗和細胞實驗，都得到了一致的結果，證明了組織芯片技術在心血管疾病研究中的準確性和可靠性，說明組織芯片技術在心血管研究中有良好的應用前景。

臨床上的冠狀動脈狹窄最常見的原因是冠狀脈粥樣斑塊形成，導致血管動脈粥樣硬化，血管腔逐漸縮窄。正常冠狀動脈中血液中的氧氣可以通過擴散作用從管腔進入血管壁，隨著血管的狹窄不斷發展，經流血管內的血流量不斷減少，從而顯著減少了氧氣向血管壁的擴散[9]。冠狀動脈的缺氧會引發氧化應激損傷，誘導血管生成因子(如 VEGF、PDGF等)的表達和釋放，同時增加促炎性細胞因子的表達，多種因子共同促刺激血管壁上的VSMCs表型轉化和增殖遷徙[10]。研究表明，VSMCs的表型轉化與血管疾病的發生、發展密切相關，其表型轉化是為了讓血管適應外界損傷，維持正常結構功能[11,12]。然而，當損傷持續存在時，VSMCs過度修復會導致內膜病理性增厚、血管壁重構，導致血管管腔狹窄，是動脈粥樣硬化、血管成形術和支架術后再狹窄等血管狹窄性疾病的共同病理基礎。血管內膜新生增加導致的內膜增厚是動脈血管針對損傷產生的反應，內膜增厚依賴于平滑肌細胞的表型轉化及其增殖遷徙能力，內膜新生時以分泌型的平滑肌細胞為主，α-SMA的表達降低。反之，當無明顯內膜新生時，收縮型VSMC增加，α-SMA表達增加，因此α-SMA可作為VSMC表型轉化的標志物[13]。血小板衍生因子(PDGF)可以通過刺激線粒體裂變，增加線粒體中的能量水平和ROS水平促進VSMCs的表型轉化和增殖遷徙能力[14，15]。因此在筆者用PDGF刺激大鼠原代血管平滑肌細胞后，可見細胞內的氧化應激水平增加，PRDX3的表達量也隨之增加。

過氧化物酶作為近年來備受關注的特異性抗氧化劑蛋白家族，在細胞的氧化應激損傷中發揮保護作用，通過減少過氧化氫等各種過氧化物來減輕氧化應激損傷。過氧化物酶家族在哺乳動物中至少有6種同工酶，通過對氧化應激水平的調節來影響細胞的增殖、分化和凋亡。PRDX3是由256個氨基酸構成，主要位于線粒體中[16，17]。Wang等研究表明，腸道缺血/再灌注(ischemia reperfusion，IR)過程中伴隨著大量活性氧(ROS)的產生，積累的ROS例如過氧化氫(H2O2)和羥基自由基，會破壞細胞脂質，蛋白質和DNA，誘導細胞凋亡，破壞腸道上皮穩態。而線粒體中的PRDX3可有效清除IR產生的ROS，在腸道的缺血再灌注損傷中起保護作用[18]。在本實驗中隨著冠狀動脈狹窄程度的增加，同樣發現了高表達的PRDX3，因此可以看出PRDX3在冠狀動脈血管的缺血缺氧中同樣可能起到保護作用，為預防和治療冠狀動脈的氧化應激損傷提供了新的靶點。

綜上所述，在不同狹窄程度的冠狀動脈血管中，可觀察到缺血缺氧可引起氧化應激，促進VSMCs的表型轉化，α-SMA表達量降低，抗氧化酶PRDX3的表達增加，且兩者呈負相關。PRDX3的抗氧化作用在冠狀動脈的缺血缺氧中起到保護作用，為預防和治療心血管的氧化應激損傷提供了新的治療靶點。