宮頸癌腫瘤相關巨噬細胞的研究進展

彭思可 蔡 晶 張 媛

宮頸癌(cervical cancer，CC)是世界范圍內第2常見的女性生殖道惡性腫瘤，發生率逐年上升，發病年齡趨于年輕化。盡管宮頸癌疫苗、根治性手術和放化療已廣泛用于預防和治療宮頸癌，但全球每年仍有50多萬新增病例[1]。耐藥、復發和轉移是病死率高的主要原因，這與腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)有關。TME主要由腫瘤細胞、骨髓源性細胞和宿主間質細胞組成，它們相互作用，形成免疫抑制微環境，從而促進腫瘤進展[2]。眾多研究表明，腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophages，TAMs)在宮頸癌進展中起關鍵作用，并在腫瘤細胞增殖、侵襲、血管生成、免疫抑制等方面與不良預后相關。本文將對巨噬細胞的來源和分類、宮頸癌中參與TAMs形成和活化的分子、巨噬細胞的生物學標志物、TAMs上PD-1的表達情況以及在CC研究中針對TAMs治療的研究現狀展開綜述。

一、巨噬細胞的來源與分類

1.組織駐留巨噬細胞：參與宮頸癌病理生理過程的巨噬細胞有兩種：組織駐留巨噬細胞和浸潤巨噬細胞。在胚胎器官發育過程中，來自卵黃囊和胎兒肝前體細胞的巨噬細胞駐留在正常、未受傷或發炎組織的上皮內或上皮上[3]。這些巨噬細胞作為常駐的、自我維持的群體存留至成年。出生后，骨髓或脾臟來源的單核細胞可在損傷、感染或炎性反應后補充組織駐留的巨噬細胞。組織駐留的巨噬細胞被認為是分化的單核細胞，其駐扎在組織中執行免疫哨兵和維持穩態的功能。然而，組織駐留的巨噬細胞并不是一個同質群體，而是一組具有相似功能和表型的細胞。目前已有研究證明，組織環境本身是巨噬細胞表型的主要控制因子，并且可以影響巨噬細胞許多基因的表達，而不受其來源的影響[4]。這些巨噬細胞在調節代謝和介導免疫炎性反應中發揮重要作用。骨破骨細胞、腦小膠質細胞、肝臟中的庫普弗細胞和肺泡巨噬細胞具有共同的功能，但也高度適應于它們的器官特異性用途[5]。

2.浸潤巨噬細胞：與組織駐留巨噬細胞不同，浸潤巨噬細胞來源于骨髓，它們的壽命相對較短，需要從循環單核細胞中不斷補充。循環單核細胞被多種炎性介質招募到腫瘤、炎癥或感染組織中，從而獲得浸潤巨噬細胞的特性。與組織駐留巨噬細胞相似，浸潤巨噬細胞可以感知局部環境的變化，并分化為特異性巨噬細胞群，促進組織穩態、免疫和炎癥。腫瘤免疫抑制微環境破壞了新招募單核細胞的正常生理功能(抗原遞呈和細胞毒性功能)，使其分化為腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)。組織中單核細胞來源的巨噬細胞在經歷生長因子、代謝需求、局部氧張力、組織細胞和基質等各種因素的影響后往往具有高度的異質性[5]。浸潤巨噬細胞主要分為M1型和M2型。Th1細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-12、TNF-α、細菌成分如脂多糖和Toll樣受體(TLR)激動劑等可誘導M1型巨噬細胞的極化[6]。M1型巨噬細胞分泌促炎性細胞因子，如IL-1β、IL-6、IL-12、IL-23、iNOS、TNF-α、CXCL-9和CXCL-10等，并表達主要組織相容性復合體Ⅰ類(MHCⅠ)和Ⅱ類(MHCⅡ)分子[7]。因此，M1型巨噬細胞參與炎性反應和抗腫瘤免疫。相反，M2型巨噬細胞由Th2細胞因子IL-4、IL-10、IL-13、TNF-α、TGF-β、GM-CSF、免疫復合物和TLRs等誘導形成，分泌多種抗炎性細胞分子，如IL-4、IL-13、IL-10、TGF-β、維生素D3、糖皮質激素和精氨酸酶1等，發揮抗炎和促腫瘤活性[6,8]。巨噬細胞可以同時具有殺瘤和致瘤的特性，這取決于細胞類型和信號微環境。在癌癥背景下，M1型可通過細胞毒性和吞噬作用發揮殺傷腫瘤作用。而M2型與不良預后相關，其血管生成和免疫抑制功能促進腫瘤生長。

二、TAMs的形成

腫瘤組織間質中的巨噬細胞增殖形成TAMs的一部分，循環單核細胞的招募也是TAMs積累的必要條件。來自腫瘤和宿主細胞的信號共同形成了TAMs的功能表型。在CC中，TAMs的形成主要與腫瘤源性分子、T細胞源性分子、精漿源性分子、厭氧微環境和其他來源的分子有關[8]。

1.腫瘤源性分子：TAMs的形成與腫瘤及腫瘤源性分子關系密切。Colegia等[9]研究證明了腫瘤細胞產生的乳酸，作為有氧或無氧糖酵解的副產品，可以誘導血管內皮生長因子的表達和腫瘤相關巨噬細胞的M2型分化，并對腫瘤細胞與巨噬細胞之間的信號傳遞具有重要意義。此外，有研究發現，用宮頸癌細胞的上清液培養單核細胞時，其趨化、吞噬和調節T細胞增殖的功能被顯著抑制，且M1型巨噬細胞出現M2型特征，CD163、TLR-3、TLR-7、TLR-9和IL-10等的表達也上調[10]。核磷脂蛋白β1(karyopherin β1)是一種核導入蛋白，參與轉運含有核定位序列的蛋白。如圖1所示，轉錄因子NF-κB和AP-1通過啟動與炎癥和癌細胞生物學相關的多種因子的表達，調控TAMs的分化[11]。抑制HeLa細胞karyopherin β1的表達可降低NF-κB和AP-1的轉錄活性，減少宮頸癌細胞的遷移和侵襲[12]。Th2細胞分泌的細胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α、GM-CSF等也是NF-κB和AP-1的靶向基因，而這些細胞因子可誘導巨噬細胞M2型分化[6]。這些結果提示karyopherin β1可能參與誘導M2型巨噬細胞分化。

CCR2-CCL2通路是腫瘤中單核細胞募集和功能定位的重要決定因素。趨化因子CCL2可以影響巨噬細胞的極化程度，因為CCL2增強了脂多糖誘導的IL-10的產生，而CCL2的阻斷可導致人巨噬細胞M1型分化相關基因和細胞因子的表達增強，M2型相關標記的表達減少[12,13]。CC細胞中CCL2 mRNA表達水平與TAMs數量呈正相關[13]。宮頸癌進展與血清中粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)水平升高有關。研究表明，CC細胞表達GM-CSF的水平與TAMs的數量呈正相關，且GM-CSF可以激活TAMs釋放促腫瘤因子[14]。IL-10可由多種細胞產生，包括HPV轉化的宮頸癌細胞。IL-10可通過上調IL-4Rα和IL-4R依賴性精氨酸酶1的表達來促進巨噬細胞M2型活化。此外，IL-10可促進精氨酸酶在脂多糖中的表達，使巨噬細胞發揮免疫抑制功能[15]。

癌蛋白可促進細胞中參與TAMs形成的分子的產生。研究數據表明，HPV感染后，HPV E2、E6、E7蛋白可促進IL-10的表達，而IL-10又會刺激HPV E6和E7的表達[16]。IL-10參與細胞向M2型巨噬細胞的分化，而M2型巨噬細胞表達高水平的IL-10[10～13,16]。因此，HPV癌蛋白和IL-10之間的相互作用形成了一個惡性循環，可能有利于宮頸癌組織內免疫抑制微環境的形成。此外，王軍等[16]研究發現高危型HPV16 E6蛋白可上調宮頸癌細胞外泌體中熱休克蛋白HSP70的表達，進而促進巨噬細胞分泌IL-6、IL-10，并介導宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲。

2.T細胞源性分子：T細胞通過分泌特異性分子，可能影響單核細胞向巨噬細胞的分化。巨噬細胞活化途徑分別為經典活化途徑和選擇性活化途徑。經典的活化途徑被定義為Th1細胞因子γ干擾素 (IFN-γ)或細菌產物如脂多糖刺激巨噬細胞M1型分化。 Th2相關細胞因子IL-4、IL-13、IL-10、TGF-β、糖皮質激素、維生素A等抗炎性細胞因子作用引起的巨噬細胞M2型分化屬于選擇性活化途徑[17]。M2型巨噬細胞在被T淋巴細胞受體激動劑激活后，共刺激分子的表達降低，IL-12p70和IL-10的平衡改變，以及刺激T細胞增殖和IFN-γ生成的能力下降，這就形成了腫瘤免疫抑制微環境[18]。腫瘤浸潤淋巴細胞可組成性表達IL-4，IL-4已被證實可以通過誘導轉錄因子kruppel-like factor 4 (KLF4)，促進骨髓源性巨噬細胞向M2型分化[19]。激活的CD4+T細胞產生的IL-17可增加宮頸癌細胞系IL-6的分泌，而IL-6對M2型巨噬細胞的分化具有重要作用。IL-17引起的腫瘤生長增強與IL-6的表達增加以及腫瘤部位巨噬細胞的招募有關[20]。以上結果提示IL-17可能參與了浸潤巨噬細胞的分化。

圖1 TAMs的招募與分化調控[11]

3.精漿源性分子和厭氧微環境:由于男性伴侶的精液是免疫調節前列腺素和細胞因子的復雜混合物，精液暴露可能影響女性生殖器炎癥微環境。用正常精漿對宮頸細胞進行體外刺激，發現IL-6、IL-8和GM-CSF的分泌濃度顯著升高，PGE2和IL-6對M2型巨噬細胞分化也有作用[20,21]。這表明精漿可能通過前列腺素影響宮頸癌巨噬細胞的分化。

TME缺氧啟動宮頸癌細胞中神經纖毛蛋白(neuropilin-1，Nrp-1)的過表達，從而招募并使巨噬細胞向M2型分化。Nrp-1和M2型TAMs已被證實與宮頸癌FIGO分期和淋巴結轉移相關[22]。

三、TAMs的生物學標志物

科學家發現，宮頸癌CD68+TAMs呈CXCL10(M1型)/CD163+(M2型)混合型，但大多為M2型[9]。CC腫瘤間質中存在M1型巨噬細胞，其IL-6、TNF-α和iNOS等M1型標志物表達下降，并在腫瘤細胞的影響下易于向M2型轉化。CC研究中，用于M1型巨噬細胞的生物學標志物有CD163-、CD163+pSTAT1、CD68+pSTAT1+、IL-6、TNF-α、iNOS、IL-12p40、CD80+、HLA-DR和CXCL10(圖1)；M2型最常見的標志物是CD163+，其他標志物有CD206+、IL-10、CD14+、CD11b+、CD204+、CD163+c-MAF+、CD68+c-MAF+、HIF-1α、PPARγ、Arg-1、Ym1、CD14+PD-L1+和CD163+CD14+[11,17]。

四、PD-1在TAMs上的表達

程序性死亡受體1(programmed cell death protein-1，PD-1)，也稱CD273，是一種免疫檢查點受體，主要表達于活化的T淋巴細胞和前體B細胞，可介導機體免疫耐受。腫瘤細胞則通常過表達PD-1的配體，即程序性細胞死亡配體1 (programmed cell death ligand 1，PD-L1)，促進腫瘤細胞免疫逃避。雖然PD-1/PD-L1阻斷激活T細胞已經得到證實，但該通路在TAMs上的作用尚不清楚。相較于活化的T淋巴細胞，PD-1在巨噬細胞上的表達水平較低，且需要脂多糖、NF -κB和α-干擾素等的刺激[23]。此外，PD-L1在TAMs上強表達，這可能導致T細胞耗竭和介導腫瘤的免疫抑制。因此，阻斷PD-L1對巨噬細胞的作用，增加T細胞的活化，從而增強抗腫瘤作用[24]。Gordon等[25]在小鼠模型中研究發現TAMs上PD-1的表達隨著時間的推移而增加，并且在原發性人類癌癥中隨著疾病的進展而增加。PD-1+的TAM可表現為M2型，而PD-1-TAM的表達譜則與M1型相似。TAM PD-1表達情況與對腫瘤細胞的吞噬能力呈負相關，體內阻斷PD-1/PD-L1通路可以增加巨噬細胞的吞噬能力，減緩腫瘤生長，延長腫瘤模型小鼠的生存時間，并呈巨噬細胞依賴的模式。研究結果表明，PD-1/PD-L1療法也可能通過對巨噬細胞的直接影響發揮作用，且2020年NCCN指南已將抗PD-1免疫檢查點抑制劑派姆單抗列為復發或轉移性PD-L1陽性宮頸癌首選二線治療方案，這對宮頸癌的免疫治療具有重要意義[26]。

五、靶向TAMs的宮頸癌治療

巨噬細胞是腫瘤炎性微環境的重要組成部分。巨噬細胞的可塑性使腫瘤免疫治療過程中改變腫瘤微環境和重建抗腫瘤免疫成為可能。靶向TAMs的主要治療策略包括抑制M2型巨噬細胞的活化，阻止單核細胞向腫瘤組織募集，激活巨噬細胞吞噬活性，阻斷PD-1/PD-L1通路對巨噬細胞的作用以增加T細胞的活化[27]。

現有研究數據表明，代表所有活化巨噬細胞的CD68+巨噬細胞并不是預后標志物，而M2型巨噬細胞與CC的關系具有特異性[28,29]。宮頸鱗狀細胞癌組織標本中腫瘤內M2型TAMs的數量顯著高于非腫瘤樣宮頸標本中上皮內M2型TAMs的數量，宮頸鱗狀細胞癌瘤周M2型TAMs的數量高于宮頸非腫瘤組織[28]。此外，宮頸腺癌中腫瘤浸潤CD204+M2型巨噬細胞密度較高，與較短的無病生存顯著相關[29]。

由于M2型TAMs被證明有致瘤作用，而M1型TAMs在CC中具有抗腫瘤作用，一些研究者開始關注M2型向M1型的轉化，認為這可能是治療上的突破。Gordon等[25]研究發現當PD-1敲除后，用酵母聚糖誘發炎性反應，可使巨噬細胞向M1型分化，這可能與PD-1敲除后胞內STAT1/NF-κB活化增強以及STAT6信號通路活化減弱相關。Heusinkveld等研究發現，宮頸癌細胞誘導的M2型巨噬細胞與CD4+Th1細胞相互作用后，可轉變為活化的M1型巨噬細胞，同時表達高水平的共刺激分子，獲得淋巴歸巢標志物CCR7，從而形成抗腫瘤微環境[20]。然而，M2型巨噬細胞與Th1細胞作用的具體機制暫不清楚。Saito等[30]研究發現，重組人血清素-干擾素(rIFN-γ)對宮頸癌細胞系具有直接的劑量依賴性抑制作用。此外，他們還發現，用rIFN-γ處理后，人腹腔積液細胞(>80%的巨噬細胞)對卵巢癌和黑色素瘤細胞株的集落生長均有很強的抑制作用。雖然缺乏直接證據，但這些結果暗示TAMs可能在rIFN-γ的影響下產生一種可擴散物質，在CC中成為殺瘤物質。此外，Nrp-1在宮頸癌缺氧TME誘導的巨噬細胞M2型分化和促腫瘤作用中起關鍵作用，干擾Nrp-1可能是治療宮頸癌的一種潛在的治療策略[22]。

六、展 望

綜上所述，循環單核細胞受多種炎性細胞因子調控被招募至宮頸癌局部病變組織中，并分化為M1型和M2型巨噬細胞，參與腫瘤免疫和免疫逃避。在腫瘤進展過程中，來自CC細胞的分子如HPV癌蛋白，特別是E6和E7，是影響巨噬細胞分化的初始因素。此外，T淋巴細胞、精漿和厭氧微環境等的相關分子也在巨噬細胞分化和選擇性活化中起著重要作用。由于M1型巨噬細胞在CC中發揮抗腫瘤作用，而M2型巨噬細胞有致瘤作用，故M2型向M1型巨噬細胞的轉化引起了研究者們的關注，這或許將成為腫瘤治療的新方向。PD-1+TAMs與M2型巨噬細胞表型相似，在抗PD-1免疫檢查點抑制劑治療宮頸癌中發揮著重要作用。TAMs作為新的免疫治療的靶點，具有巨大潛力，將對宮頸癌的治療產生重要影響。