單細胞測序技術在精原干細胞研究中的應用進展

馬 龍 顏宏利

目前，隨著環境暴露的影響和生活方式的改變，不育癥已經成為一個嚴重的社會問題,困擾著10%～15%的夫婦，其中與男性因素有關的病例約占50%[1]。為了保護和保存男性生育能力，研究者們進行了大量研究，但是目前對精原干細胞(spermatogonia stem cells，SSC)維持自我更新和分化的機制和雄配子形成的調控機制等問題還缺乏明確的認知。利用單細胞測序可以解析包括SSC在內的各種生精細胞及其微環境的中體細胞的特點，更精準地從分子層面闡釋SSC自我更新和分化、精原細胞分化和配子形成的過程，為SSC的研究以及男性不育癥的診斷和治療提供新的方向。

一、單細胞測序技術概述

傳統的測序方法通常是從多個細胞中抽提DNA或RNA進行測序，其結果往往只能代表細胞的平均水平或其中數量占優勢的細胞的水平，忽略了單個細胞獨有的特性。單細胞測序技術是從單細胞水平揭示細胞基因組、轉錄組或表觀遺傳組變化的技術，從不同角度揭示細胞在不同階段的功能和特性，可以通過一次建庫，獲得幾千個單細胞的信息[2]。單細胞測序技術能夠解決罕見細胞的分析、人組織發育分化的特征研究、腫瘤的異質性和微進化研究等傳統測序方法難以解決的問題。

1．單細胞測序技術原理:單細胞測序技術大規模應用主要得益于微滴技術的發展[3]。在實驗中，每個細胞被封裝在一個納米級微滴中(圖1)，該微滴中含有帶條形碼的聚胸腺嘧啶脫氧核苷酸。一個細胞的所有DNA或RNA與一個唯一的條形碼相關聯，使得研究者可以跟蹤單個細胞信息，從而對合并的文庫進行大規模的并列分析，可以在一次實驗中實現對數千個單細胞進行分析[4]。另一種基于小孔的策略，則不需要捕獲微滴中的細胞。單個細胞被重力驅動進入芯片的微套管，在微套管中，孔的大小只允許單個帶條形碼的珠子和單個細胞結合，從而實現單細胞的分離分析[5]。

單細胞測序技術實現的另一個重要技術突破是將唯一分子標識符(unique molecule identifier，UMI)合并進來，從而能夠更好地量化單細胞測序的讀取數。由于每個轉錄本都被唯一的UMI識別，因此這種方法可以區分反轉錄過程和cDNA擴增過程中合成的假陽性計數。其他重要的技術還有多次退火環狀循環擴增技術(multiple annealing and looping-based amplification cycles, MALBAC)。MALBAC利用特殊引物，使得擴增子的結尾互補而成環，從而很大程度上防止了DNA的指數性擴增，是目前應用最廣的全基因組擴增技術。

2.單細胞測序技術流程：單細胞測序技術主要涉及4個主要步驟，包括單細胞分離、文庫構建、基因測序和數據分析。以最常用的睪丸組織單細胞轉錄組測序為例，如圖1所示。(1)單細胞分離:睪丸組織通過機械和酶消化分離得到單細胞懸液，該單細胞懸液既可以直接進行無偏倚的篩選分析，也可以先利用流式細胞術(FACS)或免疫磁珠(MACS)等技術進行分選，再進行分析。(2)文庫構建：以10×Genomics平臺為例，其技術核心是油滴包裹的凝膠珠。該系統有75萬種唯一的帶條形碼的凝膠珠，每種珠子上有(40～80)萬個探針。油滴將含單個細胞的凝膠珠包裹起來，形成一個微滴，在微滴內完成細胞裂解、RNA反轉錄和cDNA擴增等連續步驟，最終生成文庫，其中來自單個細胞的所有cDNA共享一個條形碼。(3)基因測序：對構建得到的帶條形碼的文庫進行高通量測序。(4)數據分析：單細胞測序技術提供了大量的數據，必須利用復雜的計算工具來解釋這些數據。原始數據處理包括：①質量控制和過濾，以消除低質量序列、死細胞和多個細胞捕獲產生的干擾;基于微滴條碼分配的解碼;測序結果與參考數據庫的比對;②測序結果的標準化和量化；③聚類分析，通過擬時序分析形成細胞發展軌跡。

圖1 睪丸組織單細胞轉錄組測序示意圖

二、單細胞測序技術在SSC研究中的應用

1.揭示SSC的異質性：很多研究在對單細胞測序結果進行聚類和單細胞軌跡推斷后發現，人類SSC具有高度異質性[6～10]。不同的研究將SSC到分化精原細胞分成了3種、4種或5種不同的細胞狀態。Wang等[7]對正常供者和非梗阻性無精子癥供者的睪丸進行單細胞測序，將精原細胞分成了3個細胞群。2017年，Guo等[10]對SSEA4+SSC和c-KIT+分化精原細胞進行單細胞轉錄組和DNA甲基化組測序分析，確定了4個細胞群，并將其命名為“狀態1～4”。2018年，Guo等[9]對完整的睪丸細胞懸液進行了無偏倚實驗，又確定了附加“狀態0”。“狀態0”被排除在先前的實驗之外，可能與其參與SSEA4表達的ST3GAL2基因的低轉錄有關。“狀態0”和“狀態1”可能代表兩種不同的靜止SSC狀態。Hermann等[6]對SSC使用擬時序分析時還發現，表達已知SSC標志物的細胞位于發育軌跡的中間，提示SSC的同一性和異質性可能比預期的更為復雜。

2.揭示SSC的分子特征：很多研究利用單細胞測序技術，對已有的SSC分子標志物進行了驗證，發現了大量新的SSC分子標志物，同時也發現了調控SSC自我更新和維持未分化狀態的機制。Hermann等[6]利用擬時序軌跡分析，在起點附近發現了典型的SSC基因：GFRA1、ID4、ETV5、NANOS2、PAX7、TSPAN8、RHOX10和ZBTB16，同時還發現了一組新的基因：DUSP6、EPHA2、PTPN13、PVR和TCL1。DUSP6是一種雙特異性磷酸酶，能調節有絲分裂原活化蛋白激酶活性，PTPN13是已知的一種磷酸酶，可抑制激酶級聯活性并影響細胞代謝和增殖狀態,TCL1是絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT的共刺激因子。這提示細胞內信號通路的調控可能在SSC功能中發揮關鍵作用。其他表達量較大的基因和通路有：參與翻譯控制的基因(EIF4E、EIF4EBP1、PABPC1、RPTOR)和通路(EIF2、mTOR)，控制細胞內信號轉導的基因(F2R、GNAQ、PLCE1、PPP1CB、SHC1)和通路(PLC、Thrombin)。同時，在擬時序軌跡的中點發現了翻譯控制基因(EIF4B、MLST8、PABPC1)和通路(EIF2、mTOR)、糖酵解基因(ALDOA、ENO3、PFKL、TPI1)和已知的SSC基因(ID4、NANOS2)。在SSC亞群中也能觀察到GDNF、FGF2和WNT信號通路的上調[7,10]。這些基因和信號通路在調控SSC的自我更新和維持未分化狀態中發揮了關鍵作用[11,12]。

3.揭示睪丸體細胞的分子特征：除了生精細胞系的特征，單細胞測序技術還探索了構成睪丸組織的體細胞群之間的相互作用，包括在維持SSC自我更新、誘導SSC分化中發揮重要作用的龕位細胞。目前，對睪丸細胞的單細胞測序實驗已經提供了大量關于小鼠、人類新生兒、人類嬰兒、有生育能力的成年男性和非阻塞性無精子癥男性的SSC龕位信息[8, 9]。Guo等[9]從成人睪丸種分離出了5類細胞：Sertoli細胞、肌樣細胞、Leydig細胞、內皮細胞和巨噬細胞,這與Green等[13]在成年小鼠睪丸中分離出的細胞一致。Guo等[9]研究發現，在內皮細胞中，NOTCH通路受體NOTCH4和下游信號因子JAG1、HES1和MAML1被特異性上調。在成人肌樣細胞和Leydig細胞中，Hedgehog通路的受體PTCH1和PTCH2以及下游信號元件GLI和IGFBP6均有高表達。在Sertoli細胞中，整合素ITGA6高表達，這是一種主要存在于人類輸精管基膜中的蛋白。在Sertoli細胞還表達WFDC2和PRND，前者是一種已知的可以促進精子成熟的附睪蛋白，后者編碼一種糖基磷脂酰肌醇錨定的糖蛋白。PDGFB在內皮細胞中表達，其受體PDGFRA和PDGFRB則存在于肌樣細胞和Leydig細胞中，這提示內皮細胞可能通過與其他體細胞的串擾機制間接影響生精細胞的發育。

4.揭示精子形成的詳細過程：精子形成是一個復雜而又高度有序的過程。受標本限制，對于人類男性生殖系統的研究很大程度上需要依賴動物模型。Wang等[7]和Green等[13]于2018年分別繪制了成年男性和雄性小鼠生殖細胞成熟過程的基因表達動態圖譜。他們的工作證實了小鼠和人類精子形成過程的相似性，確認了小鼠作為研究與人類不育有關的同源基因的模型的可行性。Hermann等[6]也對小鼠和人類的生精細胞中的RNA進行了平行分析，其研究結果支持小鼠和人類之間存在轉錄組同源性的觀點，并提出可以利用小鼠生精細胞的分子標志物來鑒定人類生精細胞，為人類精子形成的探索提供支持。Law等[14]對E16.5、P0、P3和P6的小鼠睪丸進行單細胞測序分析發現，小鼠SSC的發育軌跡早在胚胎期就已經被提前設定。

目前已經有很多單細胞測序研究對人類樣本進行了分析，得到了從胎兒期的原始生殖細胞到成熟精子細胞的人類男性生殖譜系的關鍵信息[6～10,15～19]。Sohni等[8]研究發現新生兒睪丸中存在兩種生殖細胞，其中一種細胞的表達譜與胎兒期的原始生殖細胞的表達譜高度相似，另一種細胞的轉錄模式與成人SSC相似，被認為是SSC前體細胞[16]。這表明，新生兒期的SSC前體細胞可能由胎兒期的原始生殖細胞發育而來。Guo等[9]也發現嬰兒(13個月)的生殖細胞和成人(17～24歲)的“狀態0”細胞的基因表達相似，并將嬰兒的生殖細胞定位在發育軌跡的起點,隨后是“狀態0”。這些嬰兒生殖細胞代表著從1歲到青春期一直存在的靜態儲備SSC池。在人類青春期階段的精子第1波形成中出現的生殖細胞類型與在成年階段精子持續穩定形成中出現的生殖細胞類型不同，這個現象與出生后1周的小鼠模型中觀察到的現象一致[8，20]。為了描述這個過程,Guo等[19]分析了4個青春期男孩的睪丸細胞，得到了男性青春期第1波精子形成的關鍵信息。

結合已有的單細胞測序數據和免疫組化研究，人類SSC從胎兒期至成年期可分為4個相對獨立的階段：①胎兒期到新生兒期，原始生殖細胞變為SSC階段；②新生兒期到青春期前，SSC靜止或緩慢自我更新階段；③青春期早期，短暫的SSC增殖，有限且不完全的SSC分化階段；④成年期，SSC穩定的自我更新和分化發育為完整的精子細胞階段。

三、單細胞測序技術在SSC研究中的局限性和改進方向

單細胞測序技術在SSC研究中也有著局限性，現階段發展的單細胞測序技術存在耗時長、費用高、樣本要求高等問題，同時不同實驗的測序結果數據可能有很大差異。除了各種實驗標本的生物學差異外，一個主要原因是不同實驗使用的單細胞測序的技術參數不同[21]。因此在設計和評價單細胞測序研究時，應嚴格考慮以下因素：(1)生物學重復數：不同批次處理的樣品可能會產生差別，不同的細胞分離方法也可能影響其轉錄譜，因此，最好使用多個生物學重復，以增強數據的可靠性與穩健性[22，23]。(2)最終分析的細胞數量以及是否預先分選：最終分析的細胞數量對于單細胞測序是一項關鍵參數，尤其對于檢測罕見細胞類型至關重要。罕見細胞的低表達轉錄本很可能由于擴增的差異和基因缺失導致假陰性事件，因此對罕見細胞的研究可能需要預先進行細胞的分選。然而，預先使用抗體進行分選又可能會使分析產生偏倚，因此設計實驗時應當根據實驗目的選擇是否進行預先分選。(3)其他技術參數：如測序深度也必須考慮。不同測序方法中的測序深度可能有很大的差異，Svensson等[24]研究表明，單細胞測序技術的敏感度比準確性更依賴于測序深度。

單細胞轉錄組測序捕捉選定細胞特定時間點的基因表達譜，但這個表達譜是缺乏任何時間或空間的背景，而空間位置是又細胞功能和命運的決定因素。熒光原位雜交(FISH)靶向的方法可以用來彌補空間信息的缺失和補充單細胞測序數據集。利用互補的熒光標記探針，RNA可以在其自然環境中定位。RNA熒光原位雜交技術通過使用針對單個mRNA分子的多種探針，實現了組織中少數基因的表達的量化和定位。后來又研發出連續FISH法，例如Lubeck等用的與目標RNA的順序雜交的方法，增加了可檢測RNA的種類，并且實現了不同種類RNA的同時量化[25～28]。

四、展 望

2018年，美國《Science》雜志將單細胞基因活性分析技術列為年度頭號科學突破，自此引起了應用單細胞測序技術的浪潮，不少研究者認為，單細胞測序技術將會在未來10年內改變基礎生物學和醫學研究的格局。

單細胞測序技術使得SSC研究有了突破性的進展，通過對上萬個單細胞進行高通量測序，不僅可揭示精原干細胞的異質性，還可以提供精原干細胞及其微環境的分子特征，建立精子形成的動態圖譜。同時，單細胞測序技術也為男性不育癥的診療提供的新的方向：(1)可以輔助男性不育癥的診斷，實現男性不育癥更精細的分類，為后續的治療提供理論基礎。(2)可以評估可能導致精子生成受損的基因組、轉錄組或表觀遺傳組變化，實現對患者的分子靶向治療或細胞治療。(3)可以明確維持SSC體外增值的生長因子或細胞因子配方，實現SSC的體外培養，或者進一步誘導分化得到成熟的精子細胞。