離子色譜法測定口服電解質顆粒中陰、陽離子的含量

張建茹，昝艷楠，2，丁逸梅，2*

1 南京工業大學 藥學院，南京 211800；2 江蘇省藥物研究所，南京 211800

人體的電解質大部分存在于細胞內外，保持著人體的平衡，電解質參與體內許多重要的功能和代謝活動，對維持正常生命活動起著重要的作用。本文中的口服電解質顆粒原研廠家為日本味之素株式會社，目前國內沒有上市。本品為氯化鈉、氯化鉀、無水磷酸二氫鈉、檸檬酸鈉水合物、碳酸鎂、水合檸檬酸、香料、乙基香草醛、香蘭素、丙二醇等組成的顆粒，用于補充身體所需的離子。

氯離子、磷酸根離子及檸檬酸根離子的常規含量測定方法有電位滴定法[1]、高效液相色譜法[2]、氣相色譜法[3]、離子色譜[4，5]等。電位滴定法每次只能測定一種離子，消耗時間長且測定要求較高（需要相應的專用電極）；而檸檬酸根在高效液相中保留較弱，檢測器靈敏度低；而用氣相色譜法測定需衍生化等過程，操作復雜。使用離子色譜法可同時測定多種離子，且制備樣品簡單。有報道采用離子色譜法進行檸檬酸測定[6]，由于檸檬酸是弱有機酸，在離子色譜柱上保留較強，常用梯度洗脫方式與其他常見陰離子進行分離，但分析時間較長，對設備配置要求高。

目前鈉、鉀、鎂的測定方法主要有原子吸收法[3，4]、電感耦合等離子體發射光譜法（ICP-MS）[5]、滴定法[6]、電極法[7]、離子色譜法等。原子吸收法測定金屬時要進行預處理，加入消電離劑、釋放劑等，且每次只能分析一種元素。滴定法和電位法操作較為繁瑣，靈敏度不高，會造成二次污染，且當多種元素同時存在時，滴定法無法同時區分。ICP-MS 雖然靈敏度高，分析速度快，但其使用和維護成本比較高，儀器不夠普及，并且不能直接進樣進行分析[8]。

本文建立了同時快速測定氯離子、磷酸根離子、檸檬酸根離子、鈉離子、鉀離子、鎂離子含量的等度洗脫離子色譜法，具有操作簡便，直接進樣，靈敏度高等優點，是目前最常用的陰陽離子分析方法。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

930 Compact IC Flex 離子色譜儀（瑞士萬通，配自動淋洗液發生器，CO2抑制器MCS，MagIC Net 3.2 色譜工作站）；陰離子色譜柱：Metrosep A SUPP 5 column（50 mm×4 mm），陰離子保護柱：Metrosep A SUPP 5 Guard/4.0；陽離子色譜柱：Metrosep C4column（250 mm×4 mm），陽離子保護柱：Metrosep C4Guard/4.0；On-GuardH 柱及C18預處理小柱（美國戴安公司）；萬分之一天平（Sartorius，BT25S）；十萬分之一天平（Sartorius，BT25S）。

1.2 藥品與試劑

氯化鉀對照品（純度99.8%，批號：20190414）、六水合氯化鎂（純度99.8%，批號：20180804），均為國藥集團化學試劑有限公司；氯化鈉對照品（純度99.8%，批號：20180619）、一水合檸檬酸（純度99.8%，批號：20180313）、氯化鈉（純度99.8%，批號：20180619），均為南京化學試劑公司；磷酸二氫鈉（純度99.8%，批號：20180804，永華化學科技公司）；口服電解質：商品名Solita-T?granules No.3（批號：4F371、4F373、4F375、4F377、4F379，日本味之素制藥）；硝酸（純度100.0%）、碳酸鈉（純度100.0%）分析純，市售；超純水和二次去離子水（用超聲波脫氣）。

2 方法和結果

2.1 陰離子（氯、磷酸根、檸檬酸根離子）測定

2.1.1 供試品溶液的制備取本品5 包稱定，研細，精密稱取細粉適量，置50 mL 量瓶中，加水適量超聲使電解質顆粒溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液（約每毫升含氯離子1065 μg、磷酸根475 μg、檸檬酸根2160 μg）。取儲備液2.0 mL 置50 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.1.2 對照品的制備精密稱取一水合檸檬酸、氯化鈉、磷酸二氫鈉對照品適量，加水適量使溶解并稀釋成每毫升約含氯離子1065 μg，磷酸根475 μg和檸檬酸根2160 μg 的混合對照品儲備溶液，取該儲備液2.0 mL，置50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。

2.1.3 色譜條件與系統適用性試驗取一水合檸檬酸、氯化鈉、磷酸二氫鈉對照品適量，加水適量使溶解并稀釋成每毫升約含氯離子42.60 μg、磷酸根19 μg 和檸檬酸根86.4 μg 的溶液作為系統適用性溶液，采用Metrosep A Supp-5 column（150 mm×4 mm）色譜柱；流動相：碳酸鈉溶液（12.8 mmol·L-1）、等度洗脫；柱溫：30 ℃；流速：0.7 mL·min-1；進樣量：20 μL；電導檢測器。在上述條件下，各峰之間的分離度良好（Rs＞1.5），出峰順序依次為氯離子、磷酸根、檸檬酸根。色譜圖見圖1。

圖1 系統適用性色譜圖

2.1.4 專屬性取處方中不含3 種陰離子的其他成分，稀釋成與供試品、對照品相同倍數的空白溶液，與混合對照品、供試品一并分析。結果顯示，本方法測定處方中3 種陰離子的專屬性良好，不受溶液中其他成分（陽離子、香料、乙基香草醛、香蘭素、丙二醇等）的干擾，且空白輔料和溶劑中沒有干擾峰，各陰離子之間分離度良好。色譜圖見圖2。

圖2 空白溶液離子（A）、標準溶液陰離子（B）、供試品溶液陰離子（C）色譜圖

2.1.5 線性關系考察精密量取對照品儲備液1、1.4、2.0、2.6、3 mL 分別置于50 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，得相當于氯離子濃度分別為21.30、29.82、42.60、55.38、63.90 μg·mL-1，磷酸根濃度分別為9.500、13.30、19.00、24.70、28.50 μg·mL-1，檸酸根濃度分別為43.20、60.48、86.40、112.3、129.6 μg·mL-1的系列對照品溶液。按“2.1.3”項下色譜條件進樣，以樣品濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，擬合回歸方程見表1。

表1 陰離子含量測定法的線性范圍

2.1.6 檢測限和定量限取“2.1.2”項下對照品適量，等倍逐步稀釋，按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1 時，得定量限；當信噪比為3∶1 時，得檢測限。結果LOD 和LOQ氯離子分別為2.130 ng·mL-1和6.390 ng·mL-1；磷酸根分別為3.160 ng·mL-1和9.500ng·mL-1；檸檬酸根分別為54ng·mL-1和162 ng·mL-1。

2.1.7 進樣精密度試驗取“2.1.2”項下對照品溶液20 μL，按“2.1.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果氯離子、磷酸根、檸檬酸根的RSD 分別為0.14%、0.30%、0.52%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.8 穩定性試驗取“2.1.1”項下供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h，分別進樣測定，記錄色譜圖。結果氯離子、磷酸根、檸檬酸的峰面積RSD 分別為0.23%、1.6%、0.37%，表明供試品溶液在室溫24h 內穩定。取“2.1.2”項下對照品溶液，以下操作同上。結果氯離子、磷酸根、檸檬酸的峰面積RSD 分別為0.55%、1.8%、0.29%，表明對照品溶液在室溫下24 h 內穩定。

2.1.9 重復性試驗取“2.1.1”項下供試品6 份，再按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣，記錄色譜圖。結果，6 份供試品溶液中氯離子、磷酸根、檸檬酸的平均含量分別為42.11、18.48、84.98 μg·mL-1，它們的RSD分別為1.3%、0.8%、1.6%，表明本方法重現性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗精密稱定本品0.04 g，置50 mL 量瓶中，共9 份，精密加入氯離子、磷酸根、檸檬酸根質量濃度分別為1065、475、2160 μg·mL-1的混合對照品溶液7.0、8.0、10.0 mL 各3 份，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，得低、中、高（70%、100%、130%）3 個濃度，注入離子色譜儀進行測定，計算回收率，本方法的準確度良好。見表2。

表2 加樣回收率試驗結果

2.2 陽離子（鈉離子、鉀離子、鎂離子）測定

2.2.1 供試品溶液的制備取本品5 包，稱定，研細，精密稱取細粉適量，置100 mL 量瓶中，加水適量超聲振蕩使電解質顆粒溶解，用水稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液（約每毫升含鈉離子805μg、鉀離子780 μg、鎂離子36 μg）。取儲備液2.0 mL 置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.2.2 對照品的制備精密稱取氯化鈉、氯化鉀、六水合氯化鎂對照品，置于100 mL 量瓶，加水適量溶解并稀釋成每毫升約含鈉離子805 μg、鉀離子780 μg 和鎂離子36 μg 的混合對照品儲備液，取儲備液2.0 mL，置50 mL 量瓶中，加水稀釋至刻度，作為混合對照品溶液。

2.2.3 色譜條件與系統適用性試驗精密稱取氯化鈉、氯化鉀、六水合氯化鎂對照品置于100 mL 量瓶，加水適量使溶解并稀釋成每毫升約含鈉離子32.20 μg、鉀離子31.20 μg 和鎂離子1.44 μg 的混合對照品儲備液，采用Metrosep A Supp-5 column（250mm×4mm）色譜柱；流動相為硝酸溶液（12.8mmol·L-1），等度洗脫；柱溫：30 ℃；流速：0.7 mL·min-1；進樣量：20 μL；電導檢測器。在上述條件下，各峰之間的分離度良好（Rs＞1.5），出峰順序依次為鈉離子、鉀離子、鎂離子，且分離度良好。色譜圖見圖3。

圖3 系統適用性色譜圖

2.2.4 專屬性取處方中不含3 種陽離子的其他成分，稀釋成與供試品、對照品相同倍數的空白溶液，與混合對照品、供試品一并分析。結果顯示，本方法測定處方中3 種陽離子的專屬性良好，不受溶液中其他成分（陰離子、香料、乙基香草醛、香蘭素、丙二醇等輔料）的干擾，因此空白溶液中沒有干擾峰，各陽離子之間分離度良好。色譜圖見圖4。

圖4 空白溶液離子（A）、標準陽離子溶液（B）、供試品溶液陽離子（C）色譜圖

2.2.5 線性關系考察精密量取“2.2.2”項下對照品儲備液1、1.4、2.0、2.6、3 mL 分別置于50 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，得相當于鈉離子濃度分別為16.07、22.50、32.15、41.79、48.22 μg·mL-1，鉀離子濃度分別為15.69、21.97、31.39、40.80、47.08 μg·mL-1，鎂離子濃度分別為0.7290、1.021、1.458、1.896、2.187 μg·mL-1的系列對照品溶液。按“2.2.3”項下色譜條件進樣，以樣品濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，擬合回歸方程見表3。

2.2.6 檢測限和定量限取“2.2.2”項下對照品溶液適量，等倍逐步稀釋，按“2.2.3”項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。當信噪比為10∶1 時，得定量限；當信噪比為3∶1 時，得檢測限。結果LOD 和LOQ 鈉離子分別為0.0321μg·mL-1和0.107μg·mL-1；鉀離子分別為0.03138 μg·mL-1和9.500 μg·mL-1；鎂離子分別為0.001458 μg·mL-1和0.00486 μg·mL-1。

表3 陽離子含量測定法的線性范圍

2.2.7 精密度試驗取“2.2.2”項下對照品溶液20μL，按“2.2.3”項下色譜條件連續進樣測定，記錄色譜圖。結果RSD 鈉離子為0.56%、鉀離子為0.65%、鎂離子為0.97%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩定性試驗取“2.2.1”項下供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12、24 h，分別進樣測定，記錄色譜圖。結果鈉離子、鉀離子、鎂離子的峰面積RSD分別為0.32%、0.31%、1.27%，表明供試品溶液在室溫24 h 內穩定；取“2.2.2”項下對照品溶液，以下同上操作。結果鈉、鉀、鎂離子的峰面積RSD 分別為0.39%、0.32%、1.66%，表明對照品在室溫24h 內穩定。

2.2.9 重復性試驗取“2.2.1”項下供試品6 份，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以外標法計算鈉、鉀、鎂離子的含量，其含量的RSD 分別為0.2%、0.25%、0.08%，表明本方法重現性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗精密稱定本品0.04 g，置50 mL 量瓶中，共9 份，精密加入鈉、鉀、鎂離子質量濃度分別為805、780、36 μg·mL-1的混合對照品溶液0.4、1.0、1.6 mL，各3 份，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，得低、中、高（70%、100%、130%）3 個濃度，注入離子色譜儀進行測定，計算回收率，本方法的準確度良好。見表4。

表4 加樣回收率試驗結果

2.3 樣品測定

對5 批樣品照上述方法測定,按外標法計算各離子的含量，結果見表5。

表5 樣品含量測定結果（μg·mL-1）

3 討論

3.1 淋洗液條件的選擇

分離效果一方面取決于待測離子的濃度，另一方面取決于淋洗液的濃度，即淋洗液的濃度影響著分離時間和分離度。對于陰離子分析，本實驗比較了7 mmol·L-1Na2CO3+3 mmol·L-1NaHCO3+5%丙酮（圖5A）、7 mmol·L-1Na2CO3+3 mmol·L-1NaHCO3+25%丙酮（圖5B）及不用丙酮，改為12.8 mmol·L-1Na2CO33 種淋洗液對分離效果的影響。

圖5 不同淋洗條件下的色譜圖

圖5A 與圖6B 相比，隨著丙酮濃度增加，檸檬酸保留時間縮短，峰形變得尖銳。但因加入高濃度的丙酮后，基線漂移嚴重，且隨著進樣次數增加，保留時間越來越延后，還會出現抑制器飽和的現象，故不加入丙酮，逐漸改變Na2CO3的濃度，最后確定12.8 mmol·L-1Na2CO3作為淋洗液進行陰離子分子最為合適，經濟適用且環保。

在使用離子色譜測定陽離子時，大部分文獻所采用的的流動相是20 mmol·L-1甲基磺酸，本實驗采用5 mmol·L-1硝酸便可使各個離子得到很好的分離。實驗過程中考察了1、5、10、15 mmol·L-1硝酸對鈉、鉀、鎂的分離效果。結果顯示，5 mmol·L-1硝酸即可實現鈉鉀鎂的有效分離，且分離度＞1.5。見表6。

表6 標準淋洗液流速下各陽離子色譜峰分離度

3.2 抑制器轉換

過高濃度的淋洗液會使抑制器容量飽和，實驗使用了在采集時間內對抑制器進行命令，使其8 分鐘切換一次，避免抑制器飽和致使基線抬高，背景增大，且切換時間在磷酸根與檸檬酸根出峰時間之間，避免了對離子出峰的干擾。

3.3 檸檬酸根離子與等度洗脫

檸檬酸是弱有機酸，在離子色譜柱上保留較強，常用梯度洗脫方式與其他常見陰離子進行分離，但分析時間較長，對設備配置要求高。本實驗采用簡單的等度洗脫進行檸檬酸根測定，其離子能快速出峰，且峰型平穩，有效避免了梯度洗脫使基線不平穩，對儀器的配置要求高（通常需要配置四元泵或者二元泵）的麻煩。