HPLC 法同時測定琥珀酸曲格列汀中9 個雜質的含量

李 尚，徐佳雯，張 斐，2*

1 徐州醫科大學 新藥研究與臨床藥學重點實驗室，徐州 221000；2 江蘇福鋅雨醫藥科技有限公司，南京 210033

琥珀酸曲格列汀是一種二肽基肽酶Ⅳ（DPP-4）抑制劑[1]，通過選擇性、持續性抑制DPP-4，進而抑制胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）和葡萄糖依賴性促胰島素分泌多肽（GIP）的滅活，提高內源性GLP-1 和GIP 的水平，促進胰島β 細胞釋放胰島素，同時抑制胰島α 細胞分泌胰高血糖素，從而提高胰島素水平，降低血糖[2]。該藥是由日本武田公司和Furiex 公司聯合研發的全球首個1 周1 次的長效口服降糖藥（商品Zafatek）[3]，與目前市場上1 日1 次的短效產品相比，有望大幅度改善患者的便利性和依從性，并可潛在提高血糖控制，減少糖尿病并發癥。

本研究根據琥珀酸曲格列汀的合成工藝（見圖1）、降解途徑并結合強制降解試驗的結果[4]，確定了本品可能存在的雜質有9 個（結構見圖2），即雜質Ⅰ～Ⅸ。有關物質是藥品質量標準中重要的一項檢測指標，通常采用高效液相色譜法（HPLC）進行測定，在各國藥典中大多產品質量標準中采用外標法、加校正因子主成分對照法等對雜質進行定量分析，以便確定產品的有關物質變化趨勢，判斷產品質量。本試驗建立了高效液相色譜法同時對琥珀酸曲格列汀及已知的9 個雜質進行分離和含量檢測。

1 儀器及藥品、試劑

1.1 儀器

Agilent 1260 infinity Ⅱ高效液相色譜儀；Mettler ME55 電子天平（精度0.01 mg）。

1.2 藥品與試劑

琥珀酸曲格列汀（含量99.8%，批號20200401、20200402、20200421，江蘇福鋅雨醫藥科技有限公司）；雜質Ⅰ（純度97.3%，批號C19005-10-7）、雜質Ⅱ（純度95.8%，批號C19005-8-3）、雜質Ⅲ（純度96.8%，批號C19005-13-6）、雜質Ⅳ（純度97.9%，批號C19005-2-11）、雜質Ⅵ（純度97.3%，批號190627-2）、雜質Ⅶ（純度96.1%，批號190705-1），均自制；雜質Ⅴ（純度96.0%，批號14HW7302-F+1+06940A14）、雜質Ⅷ（純度95.6%，批號14HW7302-I+3+069481316）、雜質Ⅸ（純 度97.4%，批 號14HW7302-J+3+069501314）均為南京威諾德醫藥技術有限公司產品。

磷酸、乙腈為色譜級；鹽酸、過氧化氫、氫氧化鈉均為分析純；實驗用水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 雜質對照品混合儲備液取雜質Ⅰ～Ⅸ對照品適量，加乙腈溶解并稀釋制成每毫升中含各雜質100 μg 的溶液。

2.1.2 系統適用性試驗溶液取雜質對照品混合儲備液和琥珀酸曲格列汀適量，加0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解并稀釋制成每毫升中含各雜質10 μg和琥珀酸曲格列汀500 μg 的溶液。

圖1 琥珀酸曲格列汀合成路線圖

圖2 琥珀酸曲格列汀及其有關物質結構圖

2.1.3 供試品溶液稱取琥珀酸曲格列汀適量，加0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解并稀釋成每毫升中約含琥珀酸曲格列汀500μg 的溶液，濾過，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Welch Utimate AQ C18（4.6mm×250mm，5 μm）；流動相A：0.1%磷酸溶液，流動相B：乙腈，梯度洗脫：0～3 min、10%B，3～8 min、10%～15%B，8～18 min、15%～25%B，18～20 min、25%B，20～40 min、25%～65%B，40～40.1 min、65%～10%B，40.1～45 min、10%B；柱溫：35 ℃；檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.3 方法學驗證

2.3.1 系統適用性試驗取“2.1.2”項下系統適用性試驗溶液，按“2.2”色譜條件進樣并記錄色譜圖，見圖3；二極管陣列檢測器（DAD）光譜圖見圖4。在試驗結果中，琥珀酸曲格列汀和9 個雜質的分離度均大于1.5，滿足分離要求，理論塔板數均大于13000。

2.3.2 破壞性試驗精密稱定琥珀酸曲格列汀各10 mg（n=5）于20 mL 量瓶內進行強制降解試驗：①酸破壞：精密量取0.2 mol·L-1鹽酸溶液1 mL，于室溫下破壞2 h 后，加入0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解稀釋并定容至刻度，即得；②堿破壞：精密量取0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶液1 mL，于室溫下破壞4 h 后，加入0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解稀釋并定容至刻度，即得；③氧化破壞：精密量取3%過氧化氫溶液1 mL，于室溫下避光破壞5 天后，加入0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解稀釋并定容至刻度，即得；④高溫破壞：取樣品適量，于60 ℃條件下破壞5 天后，加入0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解稀釋并定容至刻度，即得；⑤光照破壞：取樣品適量，于（4500±500）Lx 條件下破壞5 天后，加入0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解稀釋并定容至刻度，即得。分別取上述破壞溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定并記錄色譜圖，見圖5。

結果表明，各降解產物峰與主成分峰均分離良好，分離度均大于1.5，且空白溶劑對雜質檢出沒有干擾，表明該法專屬性良好，同時對樣品進行物料平衡計算，各條件下破壞樣品的總峰面積均在95.0%～105.0%，物料基本守恒，試驗數據見表1。

2.3.3 線性關系考察及校正因子測定稱取雜質Ⅰ～Ⅸ和琥珀酸曲格列汀適量，加0.1%磷酸-乙腈（85∶15）稀釋成濃度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、5.0、8.0、10.0 μg·mL-1的單一成分溶液，取上述溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以質量濃度X（μg·mL-1）為橫坐標，峰面積Y 為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程，用琥珀酸曲格列汀線性回歸方程的斜率與各雜質線性回歸方程斜率比值計算各雜質的校正因子，見表2。

圖3 系統適用性試驗色譜圖

圖4 二極管陣列檢測器光譜圖

圖5 專屬性試驗HPLC 色譜圖

結果表明，雜質Ⅰ～Ⅸ和琥珀酸曲格列汀線性關系均良好，r2≥0.9999；雜質Ⅱ、Ⅵ、Ⅸ的校正因子在0.9～1.1，測定雜質含量時可采用不加校正因子的主成分對照法；而雜質Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅷ在測定含量時則需要使用校正因子進行校正。

表1 物料平衡數據

2.3.4 檢測限及定量限測定取“1.2”項下系統適用性試驗溶液，加0.1%磷酸-乙腈（85∶15）逐級稀釋后，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，按信噪比S/N=3 定為檢測限，S/N=10 定為定量限。見表2。

表2 琥珀酸曲格列汀與雜質Ⅰ～Ⅸ的線性關系、校正因子、檢測限及定量限

2.3.5 精密度試驗

進樣精密度：按照“2.1.2”項下方法配制系統適用性試驗溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，連續進樣6 次，記錄峰面積。試驗表明，琥珀酸曲格列汀和雜質Ⅰ～Ⅸ峰面積的RSD 值分別為0.1%、0.1%、0.1%、0.2%、0.2%、0.4%、0.1%、0.3%、0.2%、0.9%，結果均＜1.0%，表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取本品，按照“2.1.2”項下方法，平行配制6 份系統適用性試驗溶液，照“2.2”項下色譜條件進樣測定，利用加校正因子的主成分對照法[5]分別計算各雜質的含量，結果表明，6 份樣品的雜質含量基本一致，各雜質和總雜RSD 值均在1.0%以內，表明本方法重復性良好。

2.3.6 回收率試驗按照“2.1.3”項下方法配制9份供試品溶液，精密量取“2.1.1”項下雜質對照品混合儲備液1、2、3 mL 各3 份，分別加入到上述9 份供試品溶液中，加適量0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解并稀釋，配制成約為已知雜質限度的50%、100%、150%的供試溶液。按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，通過外標法計算出每份樣品中各雜質的測得量，根據測得量與加入量的比值計算每個雜質的回收率，并計算出每個雜質的RSD 值。試驗結果表明，雜質Ⅰ～Ⅸ的平均回收率和RSD 分別為Ⅰ：99.6%、0.8%；Ⅱ：99.8%、1.9%；Ⅲ：99.9%、0.3%；Ⅳ：99.6%、0.7%；Ⅴ：100.2%、0.9%；Ⅵ：100.5%、0.9%；Ⅶ：99.4%、1.0%；Ⅷ：100.5%、0.4%；Ⅸ：99.2%、1.4%。均在99.0%～101.0%、均＜2.0%，表明準確度較高。

2.3.7 穩定性試驗稱取琥珀酸曲格列汀25 mg，置50 mL 量瓶中，再向其中精密量取“1.2.1”項下雜質對照品混合儲備液5 mL，加入適量0.1%磷酸-乙腈（85∶15）溶解并稀釋，配制成溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12 h 后，按“2.2”色譜條件進樣測定，記錄原料藥與各雜質的峰面積。試驗表明，琥珀酸曲格列汀和雜質Ⅰ～Ⅸ的待測溶液在室溫下12 h 內RSD均＜2.0%，表明溶液穩定性良好。

2.3.8 耐用性試驗取本品系統適用性試驗溶液，分別考察在不同流速（1.0 mL·min-1±0.1 mL·min-1）和不同柱溫（35 ℃±5 ℃）的條件下，主峰和相鄰雜質的分離度及雜質含量的變化情況。由耐用性試驗看出，在本方法流速和柱溫發生微小變動的情況下，除保留時間略有變化外，對本品有關物質的檢測基本無影響，系統適用性試驗溶液各相鄰峰之間最小分離度均＞1.5，雜質Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ的RSD 值均＜5.0%（含量在0.5%～2.0%），雜質ⅢRSD值＜2.0%（含量＞2.0%）。結果表明，本法測定琥珀酸曲格列汀有關物質的耐用性良好。

2.4 有關物質檢測

取3 批琥珀酸曲格列汀，按照“2.1.3”項下方法配制供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件進樣測定，以加校正因子的主成分對照法[5]計算各雜質含量，見表3。

3 討論

色譜柱的選擇：琥珀酸曲格列汀化學結構中含有胺基、內酰胺、氰基等多種含氮基團，是一種堿性化合物；另外，作為一種鹽類物質，它具有較強的水溶性，使用常規反相色譜柱分離效果不佳，因此應選擇適合能分離堿性化合物并且耐受高比例水相的色譜柱。Welch Utimate AQ C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），是一款耐100%水相的色譜柱，對于高含水量流動相具有很好的兼容性，同時該色譜柱采用雙封端技術，對于比較難分離的堿性化合物也可獲得良好的峰型，因此，最后確定選擇該色譜柱。

表3 有關物質含量測定結果（%）

流動相的選擇：該藥pKa=8.6，在pH＞pKa+2 和pH＜pKa-2 的條件下，可以保證有良好的峰型，根據色譜柱的適用pH 范圍，選擇使用酸性體系。由于該藥在乙腈中的溶解度較高，故選擇其為有機相；在選擇水相的過程中，使用10 mmol·L-1磷酸鹽（磷酸調pH=3.0）-乙腈和10 mmol·L-1醋酸鹽（醋酸調pH=3.0）-乙腈體系時，前者會導致雜質Ⅸ的峰型不佳，后者基線不穩，影響檢測，而0.1%磷酸水溶液則可以確保雜質有良好的峰型且基線平穩。綜合考慮，最后選擇使用0.1%磷酸水溶液-乙腈體系。

檢測波長的選擇：通過二極管陣列檢測器全波長掃描結果（圖4）可知，琥珀酸曲格列汀原料藥和雜質Ⅰ～Ⅸ在230 nm 波長附近均有較強的紫外吸收，故選擇230 nm 作為本品有關物質的檢測波長。

強制降解實驗：本品在光照、酸性、高溫條件下相對來說較穩定，在堿性及氧化條件下結構均不穩定，易形成開環物，且隨反應條件加劇，雜質增長明顯。本試驗使用系統適用性溶液對雜質進行定位，可以初步確定本品在堿性條件下可產生雜質Ⅰ、Ⅲ、Ⅶ、Ⅸ；在氧化條件下產生雜質Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ。為了能夠更好地控制琥珀酸曲格列汀的質量，可以對降解實驗產生的主要雜質進行結構確證。

綜上所述，本試驗建立了一種高效、專屬性強的琥珀酸曲格列汀有關物質HPLC 法。該法可以有效分離主成分和已知雜質，可用于同時測定該原料藥中9 個雜質的含量。