尋常型銀屑病不同證候外周血miR-146a的差異表達研究*

梁 育 沈丹丹 邱桂榮

銀屑病(Psoriasis Vulgaris，PV)，中醫稱為“白疕”，俗稱牛皮癬，以皮膚紅斑、丘疹或斑片上蓋有銀白色鱗屑，不同程度的瘙癢為主要表現。其發病機制非常復雜,目前認為炎癥、表皮細胞過度增殖和免疫學異常是其發病機制的3個中心環節[1]。隨著國內外學術界在miRNA領域研究的逐步深入，發現多種miRNA在皮膚生理病理等過程中發揮了極其重要的作用。通過前期研究我們也發現miRNAs在銀屑病皮損、單個核細胞中均存在特異性差異表達。近年來，對正常人與不同疾病的患者血漿中miRNAs進行檢測，發現存在差異性表達的miRNAs，并且隨著生理情況、疾病種類以及病程的長短而變化，這就證實血循環miRNA是潛在的診斷標志物[2]。本人前期通過miRNA RealTime RT-PCR實驗驗證miRNA在正常人與銀屑病患者血漿中的表達差異，確定出5個差異倍數大于4的miRNA，其中miR-146a表達上調，且與銀屑病PASI積分呈正相關。故本次課題將研究人群擴大，不再是單純的血熱型患者，而是觀察不同中醫證候的銀屑病患者外周循環血miRNA-146a的差異性表達，以60例尋常型銀屑和20例健康人為研究對象，首先觀察個體中外周血miRNA-146a的表達水平，其次，將患者外周血中miRNA-146a的表達水平與其皮損面積和嚴重程度指數(PASI)作直線相關分析，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取江西中醫藥大學附屬皮膚科2018年6月—2019年6月門診和住院部確診為尋常型銀屑病的患者60例。將受試者按照中醫證候不同隨機分成3組，且性別、年齡必須經處理差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 納入與排除標準納入標準：符合以上西醫診斷標準和中醫證候標準；年齡18～60歲者；無其他皮膚疾患及心、肝、肺、腎、血液等系統性疾病者。排除標準：年齡小于18歲或大于60歲者；妊娠或哺乳期婦女；對治療藥物過敏者；合并有心、肝、腎、腫瘤等嚴重原發性疾病者；4周內未接受過糖皮質激素、免疫抑制劑、維A酸類及PUVA/UVB治療，2周內未使用外用制劑局部治療者。

1.3 西醫診斷標準及PASI評分法①具有典型的臨床表現：皮損以丘疹、斑丘疹和大小不等的紅色斑塊為主，覆有多層干燥銀白色鱗屑，刮除鱗屑可見一層發亮的薄膜，薄膜下可有點狀出血，不斷有新皮疹出現。進行期有同形反應，好發于頭皮、四肢伸側及腰骶部，但可發生在體表各處，發于頭皮者，毛發呈束狀；發于甲板(指、趾)者，可有頂針樣甲損害。依皮損形態可分為點滴狀、錢幣狀、地圖狀或混合型；依病程可分為進行期、靜止期和退行期[3]。②PASI評分法：皮損情況依據Fredriksson T和Petersson U指定的皮損面積和嚴重性指數(Psoriasis area and severity index,PASI)評分法。

1.4 中醫辨證標準參照中華中醫藥學會2012年頒布的《中醫皮膚科常見病診療指南》中白疕的辨證標準：①血熱內蘊證。皮疹鮮紅，不斷出現，刮去鱗屑可見發亮薄膜，點狀出血，有同形反應。可有不同程度瘙癢，伴有心煩口渴、尿黃、大便秘結。舌質紅，舌苔黃或黃膩，脈弦滑或數。②血虛風燥證。疹色淡紅，鱗屑較多而干燥，病程遷延日久，原發皮損部分消退。可有瘙癢、口干咽燥、大便干結。舌質淡紅，苔薄白，脈細。③瘀滯肌膚證。皮損肥厚浸潤，顏色暗紅，鱗屑緊固。病程遷延，斑塊局限經久不退，有不同程度瘙癢，舌質暗紅，苔薄，脈細澀[4]。

1.5 方法

1.5.1 miRNA-146a的檢測抽取患者外周血5 ml，根據Trizol說明書進行總RNA提取，對其質量檢測采用NanoDrop測定，1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。然后對提取的總RNA進行反轉錄合成cDNA，反應步驟為：在PCR儀上16 ℃ 10 min，37 ℃ 30 min，65 ℃ 5 min，收集熒光。為盡量減小逆轉錄、PCR反應及樣品間的差異，以看家基因RNU6為內參基因來標準化樣品，分別進行目的基因和看家基因的PCR，數據采用 2-△Ct法進行分析。

1.5.2 統計學方法采用SPSS 16.0軟件包進行分析，定性資料用卡方檢驗，定量資料符合正態分布用t檢驗，不符合正態分布用秩和檢驗，相關性用Pearson相關性分析。以P≤0.05為差異有統計學意義，以P≤0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 3組銀屑病患者與正常對照組外周血miRNA-146a的差異表達在3型尋常型銀屑病患者的PBMC中，miRNA-146a的相對表達水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(t=2.68，P<0.01)，miRNA-146a在血熱型患者表達水平高于血瘀組和血燥組患者，差異有統計學意義(t=2.34，P<0.01)，但血瘀組和血燥組差異無統計學意義。見表 1。

表1 各組受試者PBMC中miRNA-146a的表達水平

2.2 3組銀屑病患者外周血microRNA-146a的表達與PASI積分的相關性3組尋常型銀屑病患者的PBMC中miRNA-146a表達水平與銀屑病嚴重程度評分PASI呈正相關(r=0.68，P<0.05)。見圖1。

圖1 miRNA-146a與PASI積分的相關性

3 討論

銀屑病(Psoriasis Vulgaris，PV)是一種多因子遺傳模式的復雜疾病，涉及多個基因間的相互作用以及基因與環境的交互作用。從藥物治療手段上來看，維A酸類藥物、傳統免疫抑制劑、細胞/趨化因子抗體等藥物的作用靶環節相對單一以及各自不同的不良作用，使治療效果及臨床運用尚不能完全令人滿意。傳統的中醫中藥對銀屑病的治療有著一定的優勢，且對中醫證候的認識也形成公認的標準。前輩先賢們多以“辨血為主，從血論治”[5，6]，且實踐證明這種辨證對于治療也是行之有效的。雖然中西醫的理論基礎不同，但研究對象是一致的，所以從某種意義上說，兩者之間必然存在著共同的物質基礎。因此，我們需要尋找新的靶分子及適當的抑制途徑，從而為開辟銀屑病新的研究領域和探尋銀屑病新的治療手段提供理論依據。

miRNA是近年來發現的最小功能的非編碼小分子RNA，其參與了生命的一系列重要過程，包括發育進程、造血過程、脂肪代謝、器官形成、細胞增殖和凋亡等。以miRNA為靶點或者以miRNA為治療手段的研究也正在進行中，這些研究有助于人類疾病的早期診斷、療效及預后預測，同時也為人類疾病的治療提供了一種新的手段和方法[7]。miR-146a是一個在銀屑病中高表達的miRNA，作為一個負調控分子，可以通過互補結合于TRAF6和IRAK1的3’UTR，在轉錄后水平抑制TRAF6和IRAK1的水平，從而對天然免疫應答中的細胞內信號轉導起負反饋調節作用[8]。

通過前期研究，我們發現miRNAs在血熱型銀屑病的皮損、外周血中均存在差異性表達，且與PASI呈正相關。考慮疾病診治的整體性和全面性，且地域差異過于明顯，所以我們不再局限于血熱型患者，參考中醫證候診斷標準，納入了23例血熱型、20例血瘀型、17例血燥型患者，對其PMBCs中miRNA-146a的表達水平進行檢測，并將結果與患者PASI積分作直線相關分析，結果顯示在3型尋常型銀屑病患者的PBMCs中，miRNA-146a的相對表達水平明顯高于對照組，且血熱型患者表達水平高于血瘀組和血燥組患者，但血瘀組和血燥組差異無統計學意義，且miRNA-146a的表達水平與銀屑病嚴重程度評分(PASI)呈正相關。

綜上所述，miRNA-146a的水平與銀屑病患者臨床皮損癥狀嚴重程度密切相關，可以作為判斷病情和臨床治療效果的生物學指標之一。考慮到所有研究對象均來自同一所醫院，這可能會影響研究對象的代表性，造成地區選擇上的偏倚。另外，納入的樣本量相對較小，可能會削弱研究結果的統計學意義，故下一步有必要擴大樣本量研究。