基因組拷貝數(shù)變異測序與染色體核型分析在胎兒遺傳學診斷中的比較*

楊黎明，張華，袁路，張富青，郭華峰

（鄭州市婦幼保健院生殖遺傳科，河南鄭州 450000）

我國每年新增出生缺陷人口數(shù)約為80～120萬，據(jù)文獻報道，約20%的出生缺陷患兒是由染色體畸變引起的［1］。因此，產(chǎn)前遺傳學檢測至關重要。隨著高通量測序技術的迅猛發(fā)展，極大地推動了分子技術在臨床產(chǎn)前篩查、遺傳病檢測、腫瘤檢測、微生物病原體檢測及器官移植排斥篩查等方面的應用［2］。2019 年4 月，《低深度全基因組測序技術在產(chǎn)前診斷中的應用專家共識》指出，基因組拷貝數(shù)變異測序（copy number variation sequencing,CNV-seq）技術可以彌補染色體核型分析的不足，對于染色體病高風險胎兒，CNV-seq 技術可作為一線產(chǎn)前診斷方法［3］。而染色體核型分析作為細胞遺傳學診斷的“金標準”，廣泛應用于臨床。本研究通過比較兩種方法在產(chǎn)前胎兒遺傳學診斷中的檢出效率，來討論其應用價值，特別是在性染色體異常方面的應用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019 年9 月至2020 年7 月于鄭州市婦幼保健院有產(chǎn)前診斷指征，其接受侵入性產(chǎn)前診斷的孕婦259 例，在18～24 周進行羊水穿刺，對標本進行染色體核型分析和CNV-seq。本研究侵入性產(chǎn)前診斷取材，送檢檢測方法均遵守鄭州市婦幼保健院醫(yī)學倫理學委員會的要求，所有孕婦均進行產(chǎn)前遺傳咨詢，并被充分告知相關產(chǎn)前遺傳學診斷的必要性、局限性及風險，經(jīng)患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 研究方法

在B 超引導下進行羊水穿刺，染色體核型分析由本院細胞遺傳實驗室完成。取材后進行羊水細胞培養(yǎng)、收獲、制片及G 顯帶核型分析。使用萊卡120 全自動分析系統(tǒng)，顯微鏡下觀察計數(shù)20個分裂像，分析5 個核型，發(fā)現(xiàn)異常，加大計數(shù)至50～100 個細胞；CNV-seq 外送至鄭州大學第一附屬醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，使用Illumina NextSeq CN500 高通量測序儀（中國），二代測序法檢測。染色體核型分析根據(jù)人類細胞遺傳學國際命名體系（ISCN 2016）進行命名，CNV 致病性判讀根據(jù)美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會（ACMG）診斷標準進行。

2 結果

2.1 CNV-seq 結果

259 例標本中，共檢出染色體拷貝數(shù)異常22例，檢出率為8.49%，染色體異常和致病性的微缺失、微重復16 例，占6.18%；其中三體12 例，分別為：21 三體7 例，18 三體2 例，性染色體異常3 例（2 例克氏綜合征和1 例超雌綜合征）；染色體微缺失微重復9 例，其片段大小均小于10 Mb，其中2 例結果判斷為良性，3 例結果判斷為臨床意義未明，3 例致病，1 例為攜帶者。Xp22.31 缺失3 例，占微缺失微重復總數(shù)的1/3，性染色體嵌合1 例；三倍體1 例。見表1。

表1 兩種檢測方法檢測染色體異常的結果比較

續(xù)表1

2.2 染色體核型分析結果

259 例標本中，染色體核型分析結果顯示，共有17 例染色體異常，檢出率為6.56%。其中三體12 例，10 例與CNV-seq 結果完全一致，另2 例核型分析診斷為羅氏易位導致的21 三體，CNV 僅提示為21 三體；結構異常3 例，即羅氏易位2 例，4 號染色體臂間倒位1 例。三倍體1 例，與CNV-seq結果一致；1 例性染色體嵌合核型。見表1。

此外，還檢出染色體多態(tài)7 例，占3.20%。分別是1qh+2 例、21pstk+2 例、22ps+1 例、inv(9)(p12q13)1 例、inv(1)(p13q21)1 例。

3 討論

染色體核型分析是細胞遺傳學產(chǎn)前診斷的“金標準”，但該技術細胞培養(yǎng)時間長、分辨率低，無法診斷亞顯微水平的拷貝數(shù)變異。CNV-seq 是一項基于高通量測序技術的基因組拷貝數(shù)變異檢測，與核型分析、染色體微陣列分析等其他技術相比，不僅可以檢測染色體微陣列分析（CMA）芯片平臺所覆蓋的染色體疾病類型，還可發(fā)現(xiàn)芯片探針未覆蓋區(qū)域染色體的微缺失、微重復，且具有成本較低，重復性好，所需DNA 樣本量低等優(yōu)點［4］。很多研究對該方法的適用性進行評估，報道該技術相較于核型分析，對致病性或可能致病性有更高的檢出率，有很好的可靠性和準確性［4-5］。

本研究中，CNV-seq 與染色體核型分析對于染色體非整倍體檢測效力是一致的，一致率為100%。但無法檢出相互易位和倒位的染色體結構重排。本研究中，核型分析發(fā)現(xiàn)2 例易位型21 三體綜合征，而CNV-seq 雖然能檢出該類型21 三體，卻不能判斷其具體結構類型，因此，不能給予此類不良妊娠史婦女提供有正確的生育指導。這是由于CNV-seq 自身的技術原理所局限的，CNV-seq 是對樣本DNA 進行低深度全基因組測序，將測序結果與人類參考基因組堿基序列進行對比，通過生物信息分析發(fā)現(xiàn)樣本存在的拷貝數(shù)變異，主要是對DNA 量化判斷染色體的缺失和重復，因此，它對染色體的非整倍體以及微缺失和微重復的檢測效率較高。本研究中，通過CNV-seq 聯(lián)合STR 方法檢出三倍體1 例：69，XXX；隨后核型分析結果進行了確診。因此，染色體核型分析和CNV-seq 可以相互補充，核型也不能被取代。

其中，通過CNV-seq 檢測出3 例Xp22.31 缺失（1.68 Mb），缺失位置完全一致，包括2 例男性胎兒和1 例女性胎兒，且這三例孕婦皆是因為魚鱗病以外的臨床指征進行羊水穿刺進行CNV-seq檢測，占致病性微缺失、微重復的33.3%，可見其發(fā)病率之高。Xp22.31 雜合缺失片段包含5 個OMIM 基因，均含有XLI 的STS 主效基因，STS 與魚鱗病相關，呈 X 連鎖隱性遺傳OMIM［300747］。該缺失片段完全覆蓋類固醇硫酸酯酶（steroid sulfatase,STS）缺乏癥所在區(qū)域（X：6455812-8133195），判斷Xp22.31 缺失（含STS）為致病性CNV。其主要臨床表現(xiàn)為皮膚魚鱗狀改變，以X 連鎖隱性方式遺傳，男性多為患者，女性多為表型正常的攜帶者［6］。白周現(xiàn)等［6］的研究報道新的單中心XLI 相關Xp22.31 片段缺失的人群頻率（1.66‰）和相同位置的Xp22.31 片段重復的人群頻率（4.42‰）。其研究認為CNV-seq 檢測技術可應用于缺失型XLI 的基因診斷及產(chǎn)前診斷，并且該技術能夠同時對全基因組范圍內的拷貝數(shù)異常進行篩查。由此可見，CNV 檢測是很有必要的。

在本研究中有1 例無創(chuàng)提示性染色體非整倍體異常的病例進行產(chǎn)前診斷，其染色體核型分析的結果和CNV-seq 的結果不完全一致，CNV-seq的結果提示為胎兒Yp11.2q11.221 存在約13.16 Mb嵌合重復，異常嵌合比例約50%；Yq11.222q11.23存在約8.0 Mb 缺失。而染色體核型的結果為45，X[46]/46,X,del(Y)(q11.2)[20]，考慮為特納綜合征，饒慧華等［7］報道的胎兒CMA 中也有1 例類似報道，由此可見，對于懷疑性染色體異常時，需結合核型分析和CNV 的檢測結果以及胎兒的超聲檢查結果，綜合分析，甚至可以進一步行臍血染色體檢查或者采用熒光原位雜交技術進行驗證。有研究也認為［8］，對于染色體嵌合體不應急于終止妊娠，需采用多種方法加以驗證，并需要對胎兒形態(tài)進行細致的超聲評估，從而更加準確地確定嵌合類型以及異常核型的嵌合比例，為臨床醫(yī)師指導遺傳咨詢提供更加可靠的依據(jù)。

綜上所述，CNV-seq 與染色體核型分析對于產(chǎn)前染色體畸變的檢測各有優(yōu)勢，CNV-seq 技術有它的局限性和風險［9］，特別是對于CNV-seq 檢測結果為臨床意義不明的病例，因其預后不確定性給孕婦及家屬帶來了焦慮，也給產(chǎn)前咨詢醫(yī)師提出了挑戰(zhàn)。當胎兒檢出臨床意義不明的變異時，應該獲取父母血樣判斷來源。如果是新發(fā)突變，多考慮為致病性變異，預后差。如果是從表型正常的父母那里遺傳的，多傾向于良性變異；但部分的染色體微缺失、微重復導致的疾病存在表現(xiàn)度與外顯率的差異，同一疾病在不同患者中的臨床表型可能會存在較大的差異。因此，合理使用產(chǎn)前診斷技術，才能真正的提高染色體異常的檢出率，從而降低出生缺陷。