鳙對加壓處理前后藍藻的消化分析

王媛，劉鵬飛，徐東坡*

(1.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心 農業農村部長江下游漁業資源環境科學觀測實驗站，江蘇 無錫 214081； 2.南京農業大學 漁業學院，江蘇 南京 210095)

近20年來，中國長江中下游地區湖泊水庫的水體富營養化問題日趨嚴重，水體污染已嚴重影響了水質景觀，威脅了供水安全，甚至制約了社會和國民經濟的可持續發展[1]。2017年《水資源公報》報道了全國117個湖泊營養狀況評價結果[2]，其中，中營養湖泊占23.1%，富營養湖泊占76.9%。全國1 038座水庫營養狀況評價結果顯示，貧營養水庫占0.3%，中營養水庫占72.6%，富營養水庫占27.1%。21世紀以來，隨著經濟社會的快速發展，大量含有氮、磷營養物質的污水排入江河、湖泊、水庫，使得水中以藍藻為主體的藻類大量繁殖，形成肉眼可見的聚積體，其中以群體微囊藻形成的水華最為典型[3-4]。

藍藻是原核生物，又稱藍綠藻或藍細菌，是最簡單最原始的單細胞生物。藍藻細胞能夠產生莢膜和黏液層，主要由胞外多糖組成，具有黏滯性，從而形成網狀膠群體[5]。藍藻細胞內的氣囊是藍藻細胞浮力調節機制的關鍵結構，也是原核生物體中唯一充滿氣體的細胞器[6]，其主要特征是由剛性、中空蛋白質圓柱體組成的氣囊結構。藻細胞氣囊為藍藻提供浮力[7]，使其能夠長時間停留于水體表層光照區，從而快速生長繁殖[8]，但當壓力高于臨界壓力值(由氣囊的直徑決定)時會發生不可逆的破裂[6]。研究表明，常壓下藍藻氣囊體積占細胞總體積的28%，經0.3～0.5 MPa壓力作用后氣囊逐步減少，經0.6～0.7 MPa加壓后已觀察不到明顯的氣囊[9]。

加壓混凝技術是一種典型的物理處理技術，其原理是利用外加壓力破壞藍藻的偽空胞，再投入適當比例混凝劑使藍藻混凝沉淀。裴毅等[10]通過檢測加壓處理過的微藻水體，發現其葉綠素含量、濁度等均有降低；Nakano等[11]發現，加壓后不破壞原核細胞，所以藻毒素不會外溢，不會對水體造成新的污染。但有研究表明，在合適的光照條件下，加壓沉淀后的藍藻逐步上浮，且光照度越大(500～8 000 lx)，氣囊恢復越多[9]。而且由于藍藻細胞具有較強的上浮特性，需要投加大量的混凝劑才能達到一定的混凝效果[12-13]，所以僅僅通過加壓混凝的處理方式可能會對水體安全產生一定的威脅性。生物技術中，以生物操縱技術應用最為廣泛。1975年，Shapiro等[14]首先提出生物操縱理論以用于治理湖泊富營養化，但因淺水湖泊生態系統組成多樣，間接控藻面臨復雜的反饋機制，導致治理效果并不理想。21世紀初，謝平[15]提出的非經典生物操縱理論，因其能直接有效地控藻而被應用于實踐之中，其中，以鰱Hypophthalmichthysmolitrix、鳙Aristichthysnobilis控藻最為廣泛[16-19]。近年來，鰱、鳙控藻效果一直存在爭議，一些學者認為，鰱、鳙能夠有效消除或減輕藍藻水華的發生[19-21]，非經典生物操縱理論適用于淺水富營養化湖泊，能夠有效控制藻類數量[19-20]，武漢東湖的圍隔試驗也證明，鰱、鳙能夠有效預防微囊藻水華[22]；也有研究者認為，鰱、鳙等濾食性魚類受鰓耙間距的限制，放養會導致水體浮游生物小型化[18, 23]和微型藻類激增[18, 24]等生態問題。而且，“魚類富營養化”(ichthyoeutrophication)現象的出現可能會加速系統中營養物的再生[25]。由此可見，僅僅通過鰱、鳙控藻的效果存在不確定性，不利于生態漁業實踐工作的開展。

綜上所述，采取特定方法進行藍藻處理存在各種各樣的弊端。經實際采樣觀察發現，太湖北部湖區鳙腸道內含物中有大量的藍藻存在，故本試驗中結合物理和生物處理技術，并利用加壓破碎技術將藍藻做預處理，基于非經典生物操控理論提出的“下行作用”原理，藍藻經鳙濾食后加速了水體中氮、磷轉化效率，利用電鏡觀察藍藻形態的變化，分析了鳙對加壓破碎前后藍藻消化的差異，以期探尋更利于生態保護的綜合修復方法，為凈水漁業和環境保護提供基礎數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用鳙取自中國水產科學研究院淡水漁業研究中心養殖基地，均為當年魚種。用于室內試驗的魚種在360 L玻璃水族箱(120 cm×50 cm×60 cm)中暫養一周，每日9：00定量投喂取自太湖梅梁灣水域的藍藻(取自德林海錦園藻水分離站)，17：00吸取多余的糞便。正式試驗前兩天，選擇活力良好、體表潔凈的鳙按不同規格分別暫養于盛有180 L曝氣自來水的水族箱(60 cm×60 cm×50 cm)中，及時處理糞便，待魚腸排空后，作為試驗用魚。藍藻經鏡檢鑒定，以惠氏微囊藻Microcystiswesenbergii和銅綠微囊藻Microcystisaeruginosa為主，微囊藻屬的藻類約占99%以上，由無錫德林海環?？萍脊煞萦邢薰咎峁?/p>

1.2 方法

1.2.1 電鏡觀察試驗的設計及樣品采集與處理 電鏡試驗設置。根據餌料的不同，試驗分為加壓處理組和未加壓處理組，均在體積為100 L的水族箱(50 cm×50 cm×40 cm)中進行，養殖用水為曝氣過夜的自來水。試驗溫度為(25.0±0.5)℃，pH為7.7±0.5，溶解氧質量濃度為(8.1±0.3)mg/L，藻液密度為3.1×1010cells/L。加壓處理組，藍藻經德林海藍藻壓力試驗裝置在0.7 MPa壓力下處理1 min，鳙的體質量為(112.4±8.6)g；未加壓處理組，藍藻為原液，鳙的體質量為(115.6±7.5)g。每組6尾魚作為平行，試驗時，8:30開始配制藻液，9:00放入鳙開始正式試驗，攝食4 h后將鳙小心撈出，分別放入曝氣過夜的清水中，每缸一尾，觀察待其開始排糞便后，收集糞便并解剖試驗魚，取其中腸內含物備用。

藍藻原液和加壓處理的藻液分別收集在濾膜上；解剖魚體取中腸內含物，經PBS緩沖液沖洗而收集；收集兩組鳙所排糞便，將所有樣品放入離心管中并加入適量戊二醛溶液進行固定，編號后保存于冰箱(4 ℃)中備用。

電鏡樣品制備步驟：

1)脫水，分別用體積分數為30%、50%、70%、90%的乙醇梯度脫水各15 min，再用體積分數為100%的乙醇脫水3次，每次20 min；

2)置換，采用叔丁醇置換3次，每次30 min，叔丁醇熔點為25.69 ℃；

3)干燥，采用ES-2030型冷凍干燥儀(Hitachi)冷凍干燥，約5 h；

4)噴金，采用E-1010/E離子濺射儀(Hatachi)噴金，厚度10 nm，采用S-3000N型掃描電鏡(Hatachi)觀察并拍照。對比加壓處理前后藍藻及其被魚類攝食后在中腸和糞便中的形態差異。

1.2.2 攝食消化試驗的設計及樣品采集與處理 試驗采用灰分比例法測定消化率，試驗前用0.245 mm篩網過濾藻液，去除明顯雜質，鏡檢確定藻類密度，稀釋至加壓前后的藍藻密度(約4.0×108cells/L)，設置對比試驗；根據鳙的不同規格(81.0 g±2.1 g、103.0 g±3.1 g、130.0 g±3.4 g)將試驗設置為3組，每組6尾魚作為平行。

試驗于2017年夏季進行，期間水質維持在溶解氧質量濃度為(7.4±0.4)mg/L，溫度為(26.3±0.2)℃，pH為7.7±0.5。試驗于9:00開始，期間用黑布遮光，攝食4 h后將試驗魚撈出，分別放入曝氣過夜的清水中，每缸一尾魚，待其排糞后及時收集糞便，并編號待進一步處理。收集的糞便及濃縮的藍藻藻漿分別放入事先稱量好的坩堝中，65 ℃下烘48 h以上至恒重，干燥器中冷卻后稱其干質量并記錄，再在450 ℃下灼燒4 h后稱量其灰分質量。消化率(A)計算公式[26]為

A=(F-E)/[(1-E)F]。

其中:F為食物(藍藻)樣品中的有機質量(即干質量減灰分質量)占食物樣品干質量的比；E為糞便樣品中的有機質量占糞便樣品干質量的比。

1.3 數據處理

采用SPSS 20統計軟件進行數據分析，對不同規格和不同藻液處理方式下鳙的消化率差異進行雙因素方差分析，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 藍藻形態的變化

2.1.1 外觀形態變化 藍藻原液和加壓藻液靜置4 h后，發現藍藻原液樣品瓶中藍藻多漂浮在水面，呈暗綠色；而經0.7 MPa壓力處理后，大部分藍藻細胞下沉在瓶底，呈亮綠色(圖1)。

圖1 壓力作用前后藍藻外觀形態的變化Fig.1 Changes in appearance of cyanobacteria before and after pressure

2.1.2 攝食前藍藻形態結構的變化 電鏡觀察顯示：藍藻未做加壓處理時，藍藻細胞間膠質連接明顯，邊緣模糊，細胞圓滑，呈圓形或橢圓形(圖2(a))；而經過壓力處理后，藍藻細胞間的膠質明顯脫離，細胞多趨向于單個個體，細胞有一定程度的變形，氣囊破裂，邊緣較為清晰(圖2(b))。

2.1.3 攝食后藍藻形態結構的變化 電鏡觀察顯示：藍藻被鳙消化吸收后，中腸內未加壓處理的藍藻細胞間膠狀物質還未完全消失(圖3(a))，而加壓處理后的藻細胞已經有部分正被消化，細胞已經變形，由圓形或橢圓形變成了不規則圖形(圖3(b))；糞便內未加壓處理的藍藻細胞間膠狀物質基本消失，少量細胞已經被消化(圖4(a))，而加壓處理的藍藻細胞表面凹陷明顯，細胞壁已經破裂，大部分細胞可能正消化或者即將被消化(圖4(b))。

2.2 鳙對加壓處理前后藍藻的消化率

在相同的環境條件下進行消化率試驗，雙因素方差分析表明，不同規格的鳙對加壓處理藍藻的消化率均高于未加壓處理藍藻，其中，103.0 g組顯著高于81.0、130.0 g組(P<0.05)；81.0 g的鳙對加壓處理過的藍藻消化率(63.9%)高于藍藻原液(61.1%)，103.0 g的鳙對加壓處理過的藍藻消化率高達83.2%，對藍藻原液的消化率約為65.7%，130.0 g的鳙對加壓處理過的藍藻消化率(50.2%)高于藍藻原液(46.2%)(圖5)。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter are not significant differences.圖5 不同規格的鳙對加壓處理前后藍藻的消化率Fig.5 Digestibility of cyanobacteria before and after pressure treatment by bighead carp with different body mass

3 討論

3.1 攝食過程中加壓處理前后藍藻的形態變化

偽空胞的臨界壓力隨水深的變化而發生改變[27]，太湖屬于淺水湖泊[28]，藍藻的臨界破裂壓力為0.65～0.72 MPa，有研究表明，銅綠微囊藻的偽空胞具有較高的臨界壓力值，為0.66 MPa[29]。本試驗中采取0.7 MPa的壓力，符合其破碎要求，外觀形態上，加壓處理后的藻液呈亮綠色，未加壓的藻液呈暗綠色，這是由于加壓后光的投射能力強，散射減弱，散射濁度減小，光的透射能力增強，肉眼能觀察到的光強增加后藻細胞呈亮綠色[9]。有研究表明，電鏡觀察加壓后(0.6～0.7 MPa)藍藻的偽空胞、藻細胞外層結構并未出現明顯破損，整體結構形態未造成明顯破壞，細胞內的氣體外逸，偽空胞基本消失，細胞壁完整，細胞液未外泄[30]。這表明，加壓前后太湖水華藍藻的細胞外形基本未改變，但加壓處理后藍藻沉降性能得到強化，且細胞間膠狀物質明顯消失。還有研究顯示，微囊藻經鰱攝食后只是消化了其表面的黏液膠鞘[31]，鰱、鳙對魚糞的消化率也高于初次消化率[32]。本研究中，電鏡觀察加壓前后的藍藻細胞被攝食后的形態變化，結果顯示，未加壓的藍藻細胞在被鳙攝食后，細胞間的黏液膠鞘基本消失，少量細胞破碎，而加壓后的藍藻細胞被攝食后，細胞表面凹陷明顯，大量細胞被破碎。故可以做出預測，壓力破碎技術對于解決大量藍藻聚集水面有一定效果，且加壓處理后的藍藻細胞可能更有利于水生生物的消化吸收。

3.2 鳙對加壓處理前后藍藻的消化吸收

研究表明，魚類的腸道菌群數量和組成、消化酶活性分布受到餌料、生存環境、健康狀態等[33]多種因素的影響。電鏡觀察試驗和消化試驗結果均證明，藍藻能被鳙消化吸收。陳少蓮等[34]研究表明，鳙對微囊藻的消化率為26.1%。雷汶龍[35]研究表明，30 ～ 40 g的鰱對銅綠微囊藻的消化率為30%左右。但本試驗中鳙對液壓藍藻和藍藻原液的消化率均較高，其中，103.0 g左右的鳙對加壓處理藍藻的消化率最高(83.2%)。究其原因，一方面，雷汶龍[35]試驗對象鰱雖然也是濾食性魚類，但鰱、鳙對藻類的吸收會產生一定的差異；另一方面，其采用的是實驗室培養的銅綠微囊藻，而本試驗中所取的是天然水域的水華藍藻，藻液中所攜帶的多種細菌在鰱、鳙攝食后可能對魚體產生了刺激作用，腸道中消化酶種類、濃度、活性及分布均可能發生了變化[36]，對于其具體的消化機理，需要進行進一步的研究驗證。此外，有學者提出魚體不同生長發育階段與其體內的消化酶活性息息相關[37]。本試驗中設置了不同規格的鳙進行攝食消化試驗，其中，103 g左右的鳙消化率最高，這可能是由于其處在快速生長期，消化酶活性高，因此，所表現出來的消化性能較好。

藍藻偽空胞破碎后，光吸收面積減少，藻細胞內部散射光照強度減弱，光合作用降低，藍藻的活性基本不受影響。在適當的光照強度下，偽空胞破裂的銅綠微囊藻會在3～5 d內恢復，加壓下沉的藍藻細胞會產生不同程度的上浮，而低光照強度藍藻氣囊恢復緩慢[6,38]。所以壓力作用后，短期內如果能被魚類消化吸收，就能快速轉移藍藻的能量到更高的營養級中，從而快速轉化N、P物質。陳少蓮等[34]提出微囊藻經初次消化后排出形成的魚糞，在水體中離散呈微小顆粒狀態，若再次被攝食后更容易被鰱、鳙消化，且有研究表明，由單細胞組成、結構簡單的藻類更容易被消化[39]。本研究中，結合消化試驗和電鏡觀察試驗結果發現，液壓藍藻細胞在攝食前、中腸和糞便中的狀態均比未液壓的藍藻要更利于消化吸收，這表明，0.7 MPa壓力作用后的藍藻有利于濾食性生物對藍藻的消化利用，符合預想情況。

4 結論

單一的物理技術和生物技術處理藍藻均存在較大的不確定性，本試驗中采取綜合處理技術，結合壓力破碎技術和非經典生物操縱方法，取得的主要結論如下：

1) 加壓處理前藍藻漂浮在水面，嚴重影響水體環境和景觀；加壓處理后藍藻偽空胞破裂，下沉性可得到加強，水體透明度提高。

2) 與未加壓處理的藍藻細胞相比，加壓處理后的藍藻間膠質消失，多趨向于單個個體，邊緣清晰；經鳙攝食后，中腸內和糞便中藻細胞的凹陷程度和破裂程度均更高，說明加壓處理后藍藻細胞更容易被消化，從而加速水體氮、磷等營養元素的轉移，生態效益更大。

3) 本試驗條件下，103 g左右的鳙對藍藻的消化率最高，這可能是由于餌料組成和魚體生長發育期的不同而引起的消化酶活性的差異，但對于其具體的影響機理較為復雜，尚需進一步研究。依據本試驗結果，為提高生態效益，建議在增殖放流實踐中，可適當增加此類規格魚類的放流。

感謝水生生物資源室老師及同事對試驗提出的指導與幫助；感謝無錫德林海環保科技股份有限公司對試驗樣品準備所提供的幫助。