黑嘴病病原菌人工感染對中間球海膽吞噬作用相關免疫指標的影響

王中，張偉杰，劉雷，冷曉飛，高洪濤，江會杰，常亞青*

(1.大連海洋大學 農業農村部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧 大連 116023; 2.大連海寶漁業有限公司，遼寧 大連 116045)

中間球海膽Strongylocentrotusintermedius又稱蝦夷馬糞海膽，原產于日本北方和俄羅斯遠東沿海[1]，其生長速度快、生殖腺顏色好、味道甜，是國內外公認的優質海膽種類之一[2]。1989年中國從日本引入該種，隨后開展了其生物學、生態學、人工育苗及遺傳育種研究[1-2]。目前，該種已成為中國最主要的養殖海膽種類，其生殖腺年產量超過200 t[1]。近年來，中間球海膽養殖過程中不斷暴發黑嘴病、紅斑病和病變綜合征等各種細菌性疾病[3-7]，且有日益嚴重的趨勢。細菌性疾病已成為威脅海膽養殖效益和養殖產業發展的主要因素，而如何有效防控疾病則成為中間球海膽養殖業最迫切需要解決的問題。

解析海膽對病原的免疫機理是開展其疾病防控的基礎。研究表明，無脊椎動物對于疾病的免疫反應較為原始，缺乏真正意義上的免疫抗體，只能依靠先天性的非特異性免疫系統來抵御外來病原體的侵染[8]。吞噬細胞構成其免疫系統抵御外來病原體的第一道防線，其依靠吞噬作用對入侵的外源物質進行吞入和破壞[9]。吞噬作用在無脊椎水產動物抗菌免疫中發揮重要作用，如蝦類血細胞在其免疫防御中通過識別、吞噬、包裹、結節形成排除異物[10]。貝類血細胞可以活躍地趨化到炎癥和損傷部位進行吞噬，成為貝類免疫防御的主要細胞[11]。在海膽中，Yui等[12]研究發現，紫球海膽S.purpuratus在6 h內即可清除90%～99%進入體腔液的細菌，同時體腔細胞數量下降90%以上；Ito等[13]研究發現，光棘球海膽Mesocentrotusnudus的吞噬細胞可以有效識別并吞噬異種細胞，且體腔液中存在可增強吞噬功能的調理素；張穎[14]、李霞等[15]研究了溫度對健康中間球海膽吞噬能力影響，發現在25～30 ℃時吞噬細胞對酵母細胞的吞噬率最高；張穎等[16]發現，裙帶菜凝集素可提高中間球海膽吞噬細胞的吞噬能力。上述均是對健康海膽吞噬細胞的吞噬能力進行的研究。Zhang等[17-18]通過研究患紅斑病中間球海膽免疫基因的轉錄表達，發現海膽患病后吞噬作用相關免疫通路基因表達呈現下降的趨勢。從病菌入侵開始至海膽出現病癥期間，吞噬作用機制迄今尚未見報道，對此期間吞噬作用相關的免疫指標進行檢測，有助于揭示海膽在病菌感染下的免疫或患病機理。

本研究中，用黑嘴病病原菌對中間球海膽進行人工感染，并通過測量吞噬細胞及吞噬作用相關免疫因子隨感染時間的變化，解析中間球海膽對黑嘴病病原菌感染的免疫機理，以期為海膽疾病防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用中間球海膽(殼徑約2 cm)108只隨機選自農業農村部北方海水增養殖重點實驗室人工繁育群體。黑嘴病病原菌為本實驗室分離純化并成功回感的菌種(待發表)。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 將108只試驗海膽平分放入6個10 L滅菌水槽中，每個水槽18只，暫養1 d后開始正式試驗。試驗開始時，使用1 mL無菌注射器針頭從海膽圍口膜處刺入海膽體腔內，對海膽進行損傷，之后向水槽中加入濃度為108CFU/mL的黑嘴病病原菌液10 μL，得到浸泡脅迫濃度為102CFU/mL(預試驗結果表明，使用該濃度感染，海膽在48 h后開始出現病癥)。分別在脅迫前(0 h)和脅迫后1、6、12、24、48 h取樣，取樣方法為：從6個水槽中各隨機取1只海膽，解剖后等量吸取體腔液1 mL，混勻后取100 μL用于體腔細胞分類計數，另取900 μL用于細胞凋亡和細胞壞死檢測，剩余體腔液分裝至6個1.5 mL離心管中，4 ℃下以3 000g離心15 min，吸取上清液至1.5 mL離心管中并于-80 ℃保存，用于體腔液上清液中各免疫參數的測定，同時收集沉淀于-80 ℃下保存，用于體腔細胞中各免疫參數的測定。每個時間點按同樣的方法取樣3次作為3個重復。

1.2.2 體腔細胞分類計數 用血球計數板常規細胞計數方法，參考Smith等[19]的分類方法對體腔細胞進行分類計數。

1.2.3 吞噬相關免疫參數測定 體腔細胞及體腔液上清液中酸性磷酸酶(ACP)活力、活性氧(ROS)含量、總抗氧化能力(T-AOC)，以及細胞凋亡、細胞壞死等免疫參數均采用碧云天生物技術(上海)有限公司相關試劑盒測定，所有檢測步驟均按照試劑盒說明書操作。

1.2.4 體腔細胞總RNA提取及cDNA合成 采用Trizol法提取體腔細胞總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，采用BiochromSimpliNano超微量分光光度計(英國Biochrom公司)檢測樣品RNA的純度和濃度，采用PrimeScriptTMRT Reagent Kit(Perfect Real Time)(寶生物工程(大連)有限公司)合成cDNA第一鏈。反應體系(10 μL)：5×PrimeScript Buffer(for Real Time)2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μL，Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μL, Total RNA+RNase Free ddH2O 6.5 μL。樣品混勻后在 PCR 儀上進行反轉錄, 條件為37 ℃下反應15 min，85 ℃下反應5 s, 4 ℃下保存備用。

1.2.5 引物設計及RT-PCR 根據實驗室前期轉錄組數據[18]，篩選獲得中間球海膽補體C3前體(C3-pre)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶基因8(Caspase-8)和C型凝集素域家族成員4g(Clec4g)基因核心序列，采用Primer premier 5.0軟件對各基因設計RT-PCR引物(表1)，引物于生工生物工程(上海)有限公司合成。

RT-PCR在LightCycler?96擴增儀(Roche, 上海)上進行，使用FastStart Essential DNA Green Master試劑盒(Roche，上海)進行實時定量PCR擴增反應。PCR反應體系(20 μL):FastStart Essential DNA Green Master(2×conc)10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 6.4 μL。PCR反應程序：95 ℃下預變性10 min；94 ℃下循環變性15 s，60 ℃下退火復性60 s，共進行40個循環。用2-ΔΔCt法[20]分析各基因定量表達結果。

1.2.6 細胞的凋亡率和壞死率計算 以熒光顯微鏡下每個視野內(每個樣品取3個視野)單種細胞的凋亡細胞數除以該種細胞的總數計算得到該種細胞的凋亡率，單種細胞的壞死細胞數除以該種細胞的總數計算得到該種細胞的壞死率，并計算：

各免疫參數單細胞平均貢獻值=各免疫參數測量值/(吞噬細胞數-壞死細胞數)。

1.3 數據處理

試驗采用SPSS 20.0軟件處理相關數據，采用單因素方差分析法分析黑嘴病病原菌脅迫對體腔細胞密度及各免疫參數的影響，采用LSD多重比較法分析不同時間點上各類細胞密度、各免疫參數平均值相對于0 h變化的差異性，顯著性水平設為0.05，極顯著水平設為0.01。

2 結果與分析

2.1 病原菌脅迫對體腔細胞密度的影響

從表2可見：中間球海膽體腔液中變形吞噬細胞密度在脅迫前(0 h)為99.17×104cells/mL，在脅迫后1 h出現極顯著下降(P<0.01)，且達到最低值23.89×104cells/mL，脅迫后6 h開始逐漸恢復，至脅迫后24 h恢復至脅迫前水平(P>0.05)，之后在48 h又出現極顯著性下降(P<0.01)；無色桑椹細胞密度在脅迫前為12.50×104cells/mL，脅迫1 h后極顯著上升(P<0.01)，6 h時達到最高值25.22×104cells/mL，之后開始逐漸下降，至48 h下降至脅迫前水平(P>0.05)；脅迫后各時間點上纖毛游走細胞和紅色桑椹細胞的密度與脅迫前均無顯著性差異(P>0.05)。

表2 中間球海膽體腔細胞密度隨脅迫時間的變化

2.2 病原菌脅迫對吞噬細胞凋亡與壞死的影響

病原菌脅迫后吞噬細胞凋亡與壞死的顯微鏡觀察如圖1所示。從表3可見：中間球海膽體腔變形吞噬細胞凋亡率在病原菌脅迫后1 h呈極顯著上升(P<0.01)，脅迫后6 h時，凋亡率下降至與脅迫前無顯著性差異水平(P>0.05)，并保持至48 h；變形吞噬細胞壞死率在病原菌脅迫后1 h出現輕微下降，隨后開始上升，脅迫后12 h時極顯著升高(P<0.01)，24 h時達到最高，之后開始下降，但48 h時仍極顯著高于脅迫前水平(P<0.01)。

A—纖毛游走細胞；B—紅色桑椹細胞；C—無色桑椹細胞；D—變形吞噬細胞；E—凋亡細胞；F—壞死細胞；G—正常細胞。A—vibratile cell； B—red spherule cell； C—colorless spherule cell； D—phagocytic amoebocyte； E—apoptotic cell； F—necrotic cell； G—normal cell.圖1 病原菌脅迫后吞噬細胞凋亡與壞死的熒光顯微鏡觀察Fig.1 Fluorescence microscope observation of apoptosis and necrosis of phagocytes in sea urchin exposed to pathogen stress

表3 吞噬細胞凋亡率與壞死率隨脅迫時間的變化

2.3 病原菌脅迫對吞噬作用相關生理參數的影響

從表4可見：體腔細胞ACP酶活性在病原菌脅迫前0 h為114.99 U/L，在脅迫后總體上呈現下降趨勢，脅迫后24 h時下降約80%，達到最低值25.29 U/L，極顯著低于脅迫前(P<0.01)，脅迫后48 h有所回升；體腔細胞內活性氧含量在病原菌脅迫后6 h時達到最低值9.32×106，48 h時達到最高值12.40×106，但均與脅迫前無顯著性差異(P>0.05);體腔細胞總抗氧化能力在脅迫前為2.78 U/mg，脅迫后1 h時達到最高值3.49 U/mg，且極顯著高于脅迫前(P<0.01)，6 h后逐漸下降至與脅迫前無顯著性差異水平(P>0.05)。

從表4還可見：換算為單細胞平均貢獻值后，吞噬細胞ACP活性的單細胞貢獻值在病原菌脅迫前0 h為1.53×10-4U/L，脅迫后呈現先上升后下降的趨勢，1 h時約上升至0 h時的3倍，達到最高值4.69×10-4U/L，極顯著高于脅迫前(P<0.01)，12 h后逐漸下降至與脅迫前無顯著性差異水平(P>0.05)；活性氧含量單細胞貢獻值在病原菌脅迫后1 h時約上升至0 h時的6倍，達到最高值為76.77，24 h后下降至與脅迫前無顯著性差異水平(P>0.05)，48 h后又上升至與脅迫前有顯著性差異水平(P<0.05)；總抗氧化能力單細胞貢獻值在病原菌脅迫前為0.37×10-5U/mg，脅迫后1 h時約上升至0 h時的7倍，達到最高值2.52×10-5U/mg，且極顯著高于脅迫前(P<0.01)，12 h后雖有下降，但仍顯著高于脅迫前(P<0.05)。

表4 吞噬細胞中吞噬作用相關生理參數隨脅迫時間的變化Tab.4 Changes in phagocytosis related parameters in phagocytes with challenge time

從表5可見：體腔液上清液中ACP活性在病原菌脅迫前為0.80 U/L，脅迫后呈先上升后下降的趨勢，在1 h時達到最高值，為1.08 U/L，24 h時降到最低，但各時間點變化未達到顯著性水平(P>0.05)；血清內總抗氧化能力隨脅迫時間的變化呈先下降后上升的趨勢，在6 h時達到最低值，12 h后逐漸上升至與脅迫前相近水平，但各時間點的變化均未達到顯著性水平(P>0.05)。

表5 血清中吞噬作用相關生理參數隨脅迫時間的變化

2.4 病原菌脅迫對吞噬相關免疫基因表達的影響

以β-actin為內參基因，用RT-PCR法檢測中間球海膽吞噬細胞中C3-pre、Caspase-8和Clec4g基因的相對表達量。從表6可見：總細胞中C3-pre基因相對表達量在脅迫后1 h時約上調至0 h時的4倍，且極顯著高于0 h(P<0.01)，在之后的各個時間點上出現下調，但仍極顯著高于0 h(P<0.01)；總細胞中Caspase-8基因相對表達量出現上調，在48 h時達到最高，約上調至0 h時的2倍，且極顯著高于0 h(P<0.01)；總細胞中Clec4g基因相對表達量在脅迫后1 h時約上調至0 h時的7倍，且極顯著高于脅迫前(P<0.01)，48 h時約上調至0 h時的4倍，其余各時間點均與0 h無顯著性差異(P>0.05)。

表6 吞噬細胞中吞噬作用相關基因相對表達量隨脅迫時間的變化

3 討論

3.1 黑嘴病病原菌脅迫下吞噬細胞免疫應答機制

海膽免疫系統的主要功能之一是吞噬作用，其介導免疫應答的主要細胞是吞噬細胞，吞噬細胞可對外源粒子進行搜索、捕捉和破壞[8]。本試驗中發現，在黑嘴病病原菌感染初期(1 h)，吞噬細胞密度大幅下降，降幅達到80%，這說明當外源病原菌入侵機體時，機體通過吞噬細胞的吞噬作用進行防御，吞噬細胞殺死病原菌的同時自身消亡[17]，這一結果與Yui等[12]觀察到紫球海膽在細菌注射1 h內吞噬細胞密度下降80%的結果一致，不同之處是，紫球海膽其他3種體腔細胞也出現大幅下降，而本研究中其他3種體腔細胞未出現顯著下降，且無色桑椹細胞反而出現顯著升高，其原因尚待進一步研究。吞噬細胞密度在后期(24 h)又基本恢復正常水平，說明機體重新生成了新的吞噬細胞以應對剩余病原菌，趙新亞等[21]、Holm等[22]分別在中間球海膽和海星Asteriasrubens中檢測到LPS刺激后吞噬細胞密度的增加。在病原菌感染早期，細胞發生大量凋亡，細胞凋亡是細胞為了維持內環境穩定而發生的一種主動消亡過程[23]，說明在這一階段海膽利用細胞凋亡進行主動防御，在感染后期，細胞壞死率大幅上升，細胞壞死是細胞在致病因素作用下而發生的死亡[23]，這說明海膽免疫系統吞噬作用的免疫能力面臨崩潰。

本研究中，從吞噬細胞密度、凋亡和壞死結果可推測出海膽在病原菌侵入后迅速利用吞噬細胞進行吞噬，并通過細胞凋亡進行主動防御，在6 h時雖然有新的吞噬細胞出現并參與防御，但是細胞凋亡率降低，細胞壞死率逐漸上升，說明機體免疫能力已下降，24 h時細胞壞死率達到最高，免疫系統逐漸崩潰導致海膽患病。

3.2 黑嘴病病原菌脅迫下吞噬作用相關生理參數的免疫應答

由于吞噬細胞發生大規模的凋亡和壞死，本研究中測量體腔細胞酶活等參數后，將其計算為單個正常吞噬細胞的平均貢獻值，這一指標剔除了壞死細胞的干擾，更能準確反映海膽的免疫狀態。對比結果顯示，體腔細胞中ACP、ROS和T-AOC呈現出不同的變化趨勢，而計算為單個吞噬細胞貢獻平均值后，這些指標均一致呈現先升高后下降趨勢，這證明了單細胞貢獻平均值能更好地揭示海膽吞噬作用相關免疫反應的規律。在病原菌脅迫后早期，單細胞ACP較脅迫前上升，這說明在吞噬作用中，細胞釋放了大量的ACP[24]，用于殺滅病菌，這在早期免疫應答中可能起到重要作用，這與細菌感染后的櫛孔扇貝[25]、刺參[26]等ACP活性變化相一致。本研究中，單細胞ROS和T-AOC在病原菌感染后分別上升了約6倍和7倍，這種變化趨勢與受到脅迫后的櫛孔扇貝[27]和長牡蠣[11]相一致，這說明海膽在感染后通過伴隨吞噬作用的呼吸暴發產生大量活性氧自由基，殺死吞入的病菌[28]，同時機體受到活性氧自由基的損傷后，抗氧化能力加強，對多余的活性氧自由基加以清除，以維持機體正常[29]。在本試驗中細胞中ACP活性是血清中的約62倍，T-AOC也較血清中高，這說明吞噬后的殺菌作用相關免疫活動主要發生于體腔細胞中，而與血清關系不大。

3.3 黑嘴病病原菌脅迫下吞噬相關免疫基因的免疫應答

C3是補體激活級聯反應的中心成分，在病原體吞噬和殺滅中起著調理素的作用[8,19]。在紫球海膽中，C3通過物理標記目標細胞促進吞噬作用[30]。C型凝集素具有調理素的功能，能夠促進無脊椎動物體腔細胞的吞噬作用[31-32]。本試驗中，海膽受到黑嘴病病原菌脅迫后，吞噬細胞內C3-pre和Clec4g基因相對表達量呈極顯著上調，這與中間球海膽受到紅斑病病原菌脅迫后C3-pre和Clec4g相對表達量的變化相類似[18]，說明C3-pre和Clec4g基因在吞噬作用中起促進作用。Caspase-8是死亡受體介導的凋亡途徑中關鍵的啟動子[33]，本試驗中，Caspase-8相對表達量在48 h時約上調至0 h的2倍，極顯著高于0 h，這與草魚肝細胞受到脅迫后表達相類似[34]，吞噬細胞凋亡是海膽應對病原菌入侵的一項重要免疫措施。

3.4 海膽免疫能力指標的篩選及其在疾病防控中的應用

近年來，海膽養殖過程中幾乎每年都會發生黑嘴病，由黑嘴病導致的大規模死亡現象也時有發生[4,6-7]。為有效開展疾病防控，目前亟須找到能代表海膽免疫能力或抗病能力的指標，從而對疾病的發生開展預測或篩選抗病能力強的親本。本研究中發現，在黑嘴病病原菌脅迫后一定時間內，細胞凋亡率、單個吞噬細胞內ACP、ROS和T-AOC，以及C3-pre、Caspase-8和Clec4g基因相對表達量均極顯著高于脅迫前，因此，這些參數均可作為海膽免疫能力或抗病能力的候選指標。這些指標只需抽取海膽體腔液就可以進行測定，具有低損傷、快速、經濟、準確的優勢，有望應用到中間球海膽疾病防控研究和生產實踐中。關于指標高低與抗病力的相關性，以及指標的準確性今后需進一步研究。

4 結論

1) 病原菌入侵初期，中間球海膽迅速發揮吞噬作用，主要表現為單個有效吞噬細胞內ACP和活性氧含量分別上升約3倍和6倍，抗氧化能力上升約7倍，細胞內C3-pre和Clec4g基因相對表達量分別上調約4倍和7倍，吞噬細胞密度迅速下降；在感染后期，吞噬細胞壞死率大幅上升，上述吞噬指標均逐漸減弱。

2) 體腔細胞中ACP、ROS和T-AOC酶活性計算為單個吞噬細胞平均貢獻值后,以及C3-pre和Clec4g等基因的相對表達量能較好地反映海膽的免疫狀態。因此，這些參數可以作為海膽免疫能力或抗病能力的候選指標。