高溫脅迫下尼羅羅非魚(yú)肝臟組織的轉(zhuǎn)錄組分析

魏亞麗，周艷，3，黃思婕，魯紀(jì)剛，陳良標(biāo)，3*

(1.上海海洋大學(xué) 海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心，上海 201306； 2.水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 3.水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，上海 201306)

羅非魚(yú)隸屬于鱸形目Perciformes麗魚(yú)科Cichlid羅非魚(yú)屬Oreochromis，為廣鹽性熱帶魚(yú)類(lèi)，最適生長(zhǎng)水溫為28～32 ℃，在世界范圍內(nèi)被廣泛養(yǎng)殖[1-2]。羅非魚(yú)與其他養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)相比，具有個(gè)體生長(zhǎng)快、適應(yīng)性強(qiáng)、耐高鹽、病害少等特點(diǎn)，是目前中國(guó)重要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)之一，年產(chǎn)量高達(dá)33萬(wàn)t，居中國(guó)第三位[3]。近年來(lái)，隨著全球氣候變暖及熱污染不斷加劇，羅非魚(yú)養(yǎng)殖面臨著熱應(yīng)激帶來(lái)的不良影響。夏季經(jīng)常會(huì)發(fā)生持續(xù)性高溫現(xiàn)象，常導(dǎo)致羅非魚(yú)的新陳代謝出現(xiàn)障礙，魚(yú)體無(wú)法正常排出體內(nèi)的排泄物，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)霈F(xiàn)死亡；此外，水溫的升高加快了水體中有機(jī)物的分解速度，增加了微生物的繁殖，進(jìn)而導(dǎo)致致病菌加速生長(zhǎng)，使羅非魚(yú)的發(fā)病率升高，給水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來(lái)重大的經(jīng)濟(jì)損失[4]，嚴(yán)重威脅了羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。因此，應(yīng)用分子生物學(xué)手段，開(kāi)展羅非魚(yú)在高溫脅迫下相關(guān)功能基因的篩選及調(diào)控機(jī)理研究，對(duì)于揭示高溫脅迫下羅非魚(yú)的調(diào)控作用機(jī)制，開(kāi)展羅非魚(yú)的高溫健康養(yǎng)殖至關(guān)重要。

RNA-seq是不依賴(lài)于基因組序列的信息，可以對(duì)互補(bǔ)DNA(cDNA)進(jìn)行直接測(cè)序，是目前查找控制機(jī)體特異性狀的關(guān)鍵基因和研究基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的有效方法[5]。應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)解析機(jī)體在非生物脅迫下的復(fù)雜分子機(jī)制，也已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。Bilyk等[6]通過(guò)對(duì)博氏南冰Pagotheniaborchgrevinki在4 ℃溫度脅迫下的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，推測(cè)其在4 ℃溫度脅迫下，相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄在一定程度上受到性別的影響。Quinn等[7]發(fā)現(xiàn)，北極鮭魚(yú)Salvelinusalpinus暴露在25 ℃溫度脅迫下，機(jī)體內(nèi)Hsp和泛素的表達(dá)增加，并報(bào)道了魚(yú)類(lèi)對(duì)高溫的耐受性，具體表現(xiàn)為機(jī)體血紅蛋白基因發(fā)生下調(diào)。

目前，關(guān)于羅非魚(yú)的研究主要集中在低溫脅迫反應(yīng)[8-9]、胚胎發(fā)育[10]、性別比例調(diào)控[11]和病菌敏感性[12-13]等方面，而關(guān)于羅非魚(yú)在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行的高溫適應(yīng)機(jī)理方面研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，基于RNA-seq技術(shù)對(duì)尼羅羅非魚(yú)Oreochromisniloticus受到高溫脅迫后的肝臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，以揭示羅非魚(yú)在高溫脅迫下與常溫對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄差異，并從中挖掘關(guān)鍵基因及調(diào)控途徑，以期為羅非魚(yú)在持續(xù)性高溫下的健康養(yǎng)殖管理，以及了解羅非魚(yú)高溫脅迫響應(yīng)的調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用尼羅羅非魚(yú)親魚(yú)均來(lái)自廣西南寧某羅非魚(yú)良種場(chǎng)，平均體質(zhì)量約為400 g，健康有活力且無(wú)疾病感染，于上海海洋大學(xué)羅非魚(yú)養(yǎng)殖基地養(yǎng)殖。待雌雄魚(yú)性腺發(fā)育成熟后，通過(guò)人工授精方式，收集尼羅羅非魚(yú)同一家系的受精卵(約1 000粒)。正式試驗(yàn)前在溫度為(28.0±0.2)℃、pH為8的環(huán)境中進(jìn)行受精卵的人工孵化，于孵化12 d后開(kāi)始試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將羅非魚(yú)幼魚(yú)隨機(jī)分為試驗(yàn)組 (36 ℃) 和對(duì)照組 (28 ℃)，每組約300尾。試驗(yàn)組初始水溫為28 ℃，按每天升高1 ℃的速度升溫，升高至36 ℃時(shí)停止升溫，繼續(xù)養(yǎng)殖70 d。分別在養(yǎng)殖30、50、70 d時(shí)，從各組隨機(jī)取3尾麻醉后，統(tǒng)計(jì)其體長(zhǎng)、體質(zhì)量等指標(biāo)，然后解剖采集高溫組和對(duì)照組的肝臟組織樣品，分別記為36 ℃-30 d、36 ℃-50 d、36 ℃-70 d、28 ℃-30 d、28 ℃-50 d、28 ℃-70 d，將各樣品迅速轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中并置于液氮中速凍后于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存。養(yǎng)殖試驗(yàn)期間，每天早晚投喂兩次，每天換水一次，每次換水量為總量的1/3，換水前將新水預(yù)熱至試驗(yàn)溫度。為減少誤差，各組取樣的過(guò)程均在同一時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行，在各時(shí)間點(diǎn)從試驗(yàn)組與對(duì)照組隨機(jī)取3尾。

1.2.2 總RNA的提取、文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序 利用Trizol法分別對(duì)高溫組和對(duì)照組肝臟組織樣品進(jìn)行總RNA的提取，并使用DNaseⅠ(TaKaRa，中國(guó))消化樣品中殘留的基因組DNA。采用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA降解及污染程度，采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的總RNA的純度及濃度。根據(jù)Liu等[14]將組織樣品進(jìn)行混樣的方法來(lái)消除個(gè)體間的差異，本試驗(yàn)中將各時(shí)間點(diǎn)每3尾魚(yú)的肝臟組織樣品進(jìn)行等量混合，從每個(gè)時(shí)間點(diǎn)組織樣品中取3 μg RNA用于文庫(kù)構(gòu)建，文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序工作由北京諾禾致源公司完成。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 首先通過(guò)FastQC評(píng)估原始數(shù)據(jù)的質(zhì)量，使用 Trimmomatic 對(duì) raw data 進(jìn)行處理，以去除帶接頭和低質(zhì)量的堿基，得到高質(zhì)量的clean data，且后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組分析均基于高質(zhì)量的clean data。TopHat2是一個(gè)來(lái)自RNA測(cè)序試驗(yàn)reads的高效比對(duì)系統(tǒng)[15]，本研究中以羅非魚(yú)的基因組作為參考進(jìn)行序列比對(duì)及后續(xù)的分析，使用TopHat2比對(duì)系統(tǒng)將得到的clean reads與羅非魚(yú)參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)(參考基因組下載地址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome)。

根據(jù)FPKM法[16]計(jì)算每個(gè)基因在不同樣本中的表達(dá)量。使用DESeq軟件包[17]對(duì)羅非魚(yú)高溫組和對(duì)照組進(jìn)行差異表達(dá)分析，根據(jù)FPKM法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，用Benjamini-Hochberg法控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate, FDR)以調(diào)整所得的P值，將fold change≥2且FDR<0.05作為差異表達(dá)基因檢測(cè)過(guò)程中的篩選標(biāo)準(zhǔn)。最后用 Cluster Profile 軟件包對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析，P<0.05時(shí)表示差異基因顯著富集。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 根據(jù)差異基因?qū)Ω邷孛{迫的響應(yīng)程度，本研究中通過(guò)RT-qPCR試驗(yàn)對(duì)蘇氨酸/絲氨酸激酶(mTOR)及其相關(guān)信號(hào)通路中的8個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行了驗(yàn)證，以此評(píng)價(jià)RNA-seq方法鑒定差異基因的可靠性。使用Primer 3.0軟件對(duì)各差異基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)，并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物。

表1 RT-qPCR引物設(shè)計(jì)Tab.1 Primers for RT-qPCR

使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa,Dalian)將各樣品的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,以β-actin為內(nèi)參基因，使用FastStart Universal SYBR?Green Master(ROX)試劑，采用CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，采用2-△△CT方法計(jì)算出各候選基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 尼羅羅非魚(yú)體長(zhǎng)、體質(zhì)量指標(biāo)分析

通過(guò)對(duì)持續(xù)性高溫處理過(guò)程中(30、50、70 d)羅非魚(yú)體長(zhǎng)、體質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，在高溫階段羅非魚(yú)的生長(zhǎng)受到水溫的限制[18]，與對(duì)照組(28 ℃)相比，隨著高溫(36 ℃)處理時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，羅非魚(yú)的體長(zhǎng)、體質(zhì)量增加速率逐漸變慢(圖1、圖2)。

圖1 尼羅羅非魚(yú)體長(zhǎng)的變化趨勢(shì)Fig.1 Trend chart of body length in Nile tilapia Oreochromis niloticus

圖2 尼羅羅非魚(yú)體質(zhì)量的變化趨勢(shì)Fig.2 Trend chart of body mass in Nile tilapia Oreochromis niloticus

2.2 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)及比對(duì)分析

對(duì)羅非魚(yú)高溫組(36 ℃-30 d、36 ℃-50 d、36 ℃-70 d)和對(duì)照組(28 ℃-30 d、28 ℃-50 d、28 ℃-70 d)肝臟組織樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得39.23 Gb clean data(表2)。各樣品的clean data數(shù)均達(dá)到6.18 Gb以上，Q30堿基百分比均在91.45%以上。將各樣品的clean reads與尼羅羅非魚(yú)基因組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)效率均在82.37% 以上，這表明此次測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量和序列比對(duì)情況Tab.2 Sequencing data quality and sequence alignment

2.3 差異表達(dá)基因分析

通過(guò)DEseq軟件包進(jìn)行樣品組間的差異表達(dá)分析，在|log2(fold change)|≥1且FDR<0.05條件下，獲得了高溫脅迫不同時(shí)間點(diǎn)肝臟組織樣品的差異基因表達(dá)情況。28 ℃-30 d與36 ℃-30 d文庫(kù)比較中，檢測(cè)到4 342個(gè)差異表達(dá)基因，其中，3 026個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1 316個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；28 ℃-50 d與36 ℃-50 d文庫(kù)比較中，檢測(cè)到3 139個(gè)差異表達(dá)基因，其中，1 352個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1 787個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；28 ℃-70 d與36 ℃-70 d文庫(kù)比較中，檢測(cè)到3 042個(gè)差異表達(dá)基因，其中，1 702個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，1 340個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖3)。這表明，在持續(xù)性高溫脅迫下，差異基因的表達(dá)發(fā)生了明顯變化，且呈現(xiàn)出不同的高溫應(yīng)答模式。

圖3 差異表達(dá)基因數(shù)目統(tǒng)計(jì)Fig.3 Number of differentially expressed genes(DEG)

2.4 差異基因GO功能分析

因差異表達(dá)基因較多，為深入探究羅非魚(yú)在持續(xù)性高溫脅迫下的調(diào)控機(jī)制，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，將差異表達(dá)基因歸類(lèi)到GO 3大分支(生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能)的26個(gè)子類(lèi)別中(圖4)。其中，28 ℃-30 d與36 ℃-30 d文庫(kù)比較中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、絲氨酸水解酶活性、細(xì)胞發(fā)育過(guò)程及細(xì)胞分化等調(diào)控過(guò)程中差異表達(dá)基因顯著富集；28 ℃-50 d與36 ℃-50 d文庫(kù)比較中發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞對(duì)外來(lái)生物的反應(yīng)、細(xì)胞修飾氨基酸代謝過(guò)程、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期等調(diào)控過(guò)程中存在差異表達(dá)基因富集現(xiàn)象；28 ℃-70 d與36 ℃-70 d文庫(kù)比較中發(fā)現(xiàn)，脂類(lèi)生物合成過(guò)程、類(lèi)固醇代謝過(guò)程中存在差異表達(dá)基因富集現(xiàn)象。在高溫脅迫過(guò)程中，應(yīng)激反應(yīng)、能量代謝等調(diào)控過(guò)程中差異基因富集較為顯著，這表明在高溫脅迫下，在羅非魚(yú)肝臟組織中產(chǎn)生了大量參與調(diào)控代謝等相關(guān)的活動(dòng)過(guò)程。

2.5 KEGG富集分析

為了進(jìn)一步探究在持續(xù)性高溫脅迫下差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析，以P<0.05為閾值，本試驗(yàn)中選取了前17條顯著富集的代謝通路(圖5)。在高溫脅迫的不同時(shí)間下，差異表達(dá)基因在萜骨架生物合成通路、細(xì)胞周期、糖酵解/糖異生、精氨酸/脯氨酸的代謝通路、胰島素信號(hào)通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工通路及mTOR信號(hào)等通路中顯著富集。其中，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路的差異基因數(shù)目最多，該通路涉及27個(gè)差異基因，且與高溫脅迫最為相關(guān)的熱應(yīng)激蛋白基因Hsp70和Hsp90就屬于這個(gè)通路。

圖5 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證分析

為了驗(yàn)證RNA-seq所得結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究中通過(guò)RT-qPCR試驗(yàn)對(duì)mTOR及其相關(guān)信號(hào)通路中的8個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證。各基因的表達(dá)情況及各基因的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果如圖6所示，雖然表達(dá)量存在一定的偏差，但兩者在整體上的表達(dá)趨勢(shì)一致，由此證明本研究中轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果的可靠性。

圖6 各差異表達(dá)基因的RT-qPCR驗(yàn)證Fig.6 Validation of the differentially expressed genes by RT-qPCR

3 討論

近年來(lái)，隨著全球氣溫升高的情況日益加劇[19]，羅非魚(yú)的養(yǎng)殖面臨著熱應(yīng)激帶來(lái)的諸多不良影響。已有大量研究表明，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)逐漸在水產(chǎn)動(dòng)物各方面的研究上發(fā)揮著重要的作用，比如應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物在免疫應(yīng)答反應(yīng)、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程等方面進(jìn)行的研究[20]。本研究中，通過(guò)對(duì)羅非魚(yú)在持續(xù)性高溫脅迫下的肝臟組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)參與熱應(yīng)激相關(guān)的基因涉及生長(zhǎng)、能量代謝及蛋白質(zhì)折疊等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，對(duì)魚(yú)類(lèi)高溫狀態(tài)下的生存有著重要的作用。

3.1 高溫脅迫下羅非魚(yú)的生長(zhǎng)調(diào)控分析

生長(zhǎng)激素 (growth hormone，GH) -胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGF)體系，通常被認(rèn)為是脊椎動(dòng)物包括魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)內(nèi)分泌調(diào)控軸的核心。已有研究表明，GH-IGF體系在魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)調(diào)控方面發(fā)揮著重要的作用，腦垂體分泌生長(zhǎng)激素(GH)后，GH通過(guò)相應(yīng)受體的介導(dǎo)以刺激肝臟和其他組織中合成并分泌IGF-1，且在其他組織中主要通過(guò) IGF受體的介導(dǎo)機(jī)體發(fā)揮各種生物功能[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體中IGF-1或IGF-2的缺失均將導(dǎo)致個(gè)體質(zhì)量的損失[22-23]；代謝通路中insulin/PI(3) K信號(hào)通路[24]在調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)方面發(fā)揮著重要的作用。本研究中，通過(guò)對(duì)羅非魚(yú)高溫處理組和常溫對(duì)照組差異表達(dá)基因分析發(fā)現(xiàn)，在高溫脅迫(30、50、70 d)過(guò)程中，肝臟組織中有關(guān)生長(zhǎng)軸調(diào)控的重要因子IGF-1及相關(guān)受體基因的表達(dá)均呈現(xiàn)顯著下調(diào)。由此推測(cè)，羅非魚(yú)神經(jīng)內(nèi)分泌方面的調(diào)控在一定程度上抑制了羅非魚(yú)的生長(zhǎng)。同時(shí)，通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，胰島素信號(hào)通路被顯著富集，主要參與羅非魚(yú)的生長(zhǎng)調(diào)控。當(dāng)然，生長(zhǎng)軸的調(diào)控還受到多種因子和調(diào)控模式的共同作用，有關(guān)羅非魚(yú)神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制的研究還有待后期深入探究。

3.2 高溫脅迫下羅非魚(yú)的代謝響應(yīng)分析

在應(yīng)激條件下，變溫性魚(yú)類(lèi)的代謝活動(dòng)高度依賴(lài)于環(huán)境溫度。在多種魚(yú)類(lèi)如斑馬魚(yú)[25]、大黃魚(yú)[26]等溫度應(yīng)激的研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞對(duì)環(huán)境溫度升高得最快反應(yīng)之一是機(jī)體代謝速率的改變。本研究中，通過(guò)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)，這些差異基因也主要參與代謝相關(guān)的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程；GO功能富集分析顯示，差異表達(dá)基因富集較為顯著的GO Term主要分布在脂質(zhì)代謝過(guò)程、細(xì)胞修飾氨基酸代謝過(guò)程、類(lèi)固醇代謝過(guò)程及蛋白質(zhì)代謝過(guò)程等；KEGG富集分析也顯示，代謝相關(guān)的通路被顯著富集，如氨基酸的生物合成、萜類(lèi)化合物、精氨酸/脯氨酸代謝及脂類(lèi)代謝等通路。由此推測(cè)，羅非魚(yú)在應(yīng)對(duì)持續(xù)性高溫脅迫的過(guò)程中，機(jī)體內(nèi)的新陳代謝和能量消耗不斷增強(qiáng)，差異基因可能更多地通過(guò)代謝通路相互作用的方式共同應(yīng)答高溫脅迫。

3.3 高溫脅迫下羅非魚(yú)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工通路分析

早期研究表明，當(dāng)機(jī)體處于環(huán)境脅迫的條件下，機(jī)體內(nèi)許多酶和結(jié)構(gòu)蛋白的功能和結(jié)構(gòu)均會(huì)發(fā)生改變，機(jī)體此時(shí)則通過(guò)激發(fā)熱應(yīng)激蛋白的合成保護(hù)自身抵抗逆境。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)不僅是細(xì)胞內(nèi)Ca2+的貯存場(chǎng)所，也是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，其在蛋白質(zhì)的合成轉(zhuǎn)運(yùn)及糖基化修飾等方面發(fā)揮著重要的作用，具有重要的生理功能。值得注意的是，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的蛋白質(zhì)加工通路在持續(xù)性高溫脅迫下，參與該通路的差異基因數(shù)目最多，且差異基因表達(dá)明顯上調(diào)，其中，參與肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性降解(ERAD)過(guò)程的Hsp70和Hsp90表達(dá)顯著上調(diào)，Hsp90家族蛋白在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)及細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)方面發(fā)揮著重要的作用[27]。早期研究表明，在熱應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體中Hsp相關(guān)基因的表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié)不同的細(xì)胞功能保護(hù)機(jī)體免于遭受熱應(yīng)激帶來(lái)的傷害[28]。本研究中，熱應(yīng)激蛋白Hsp70和Hsp90發(fā)生了顯著上調(diào)，推測(cè)熱應(yīng)激蛋白受高溫脅迫時(shí)激發(fā)表達(dá)的特性，這些伴侶蛋白與變性蛋白質(zhì)間相互作用，防止其發(fā)生聚集和錯(cuò)誤折疊，可以使羅非魚(yú)盡可能地避免高溫帶來(lái)的傷害。

4 結(jié)論

1)通過(guò)對(duì)尼羅羅非魚(yú)高溫處理組和常溫對(duì)照組進(jìn)行體長(zhǎng)、體質(zhì)量指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)高溫限制了羅非魚(yú)的生長(zhǎng)。

2)通過(guò)分析尼羅羅非魚(yú)肝臟組織在高溫脅迫下與常溫對(duì)照組的轉(zhuǎn)錄差異，發(fā)現(xiàn)高溫影響尼羅羅非魚(yú)肝臟組織基因表達(dá)水平，差異基因主要富集在氨基酸代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的蛋白質(zhì)加工及胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的多個(gè)通路。

3)通過(guò)RT-qPCR試驗(yàn)對(duì)mTOR及其相關(guān)信號(hào)通路中的差異表達(dá)基因行驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果基本一致。

4)高溫對(duì)羅非魚(yú)的生長(zhǎng)、能量代謝及蛋白質(zhì)折疊有著顯著的影響，本試驗(yàn)結(jié)果為解析羅非魚(yú)高溫脅迫響應(yīng)的復(fù)雜分子機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)，為發(fā)展羅非魚(yú)高溫健康養(yǎng)殖管理技術(shù)和進(jìn)一步研究和培育其他魚(yú)類(lèi)的耐高溫性狀提供了數(shù)據(jù)參考。