母源因子boule在光棘球海膽性腺中的表達與定位

韓亞倫，魏金亮，崔洲平，張健，張偉杰，溫斌，常亞青，孫志惠

(大連海洋大學 農業農村部北方海水增養殖重點實驗室，遼寧 大連 116023)

精子缺乏基因(deleted in azoospermia,DAZ)是精子生成調控因子，DAZ基因家族成員均包含一個保守的RNA結合結構域，并在生殖細胞中特異表達。由DAZ基因家族編碼的RNA結合蛋白在調控動物生殖細胞分化與發育過程中發揮重要作用[1-3]。目前,在DAZ基因家族中，研究較多的基因為boule、daz和dazl，其中，boule和dazl位于常染色體，daz位于Y染色體。boule是DAZ基因家族的最原始成員，在生殖細胞中特異表達，其分子結構和功能高度保守[4-5]。

boule基因在調控生殖細胞發育和分化的過程中發揮了重要作用，在不同物種中其表達模式也不同。在哺乳動物中，boule在精巢中特異表達，缺失boule會導致生精細胞分化為成熟精子的過程受阻，使人類患無精子癥[6]；在果蠅中，boule也在精巢中特異表達，缺失boule會使精子發生的進程一直停滯在初級精母細胞向次級精母細胞分化的階段，從而使精子發生停止[7]；在線蟲中，boule僅在卵巢中表達[8]，boule的缺失會使卵子發生的減數分裂過程受阻，從而造成卵子發生障礙[9]；在淡水養殖動物中，青鳉和虹鱒卵巢和精巢中均能檢測到boule的表達[10-11]；在海水養殖動物中，櫛孔扇貝boule在除了成熟精子外的一切雄性生殖細胞的細胞質中表達[12]，紫海膽boule在其精巢中表達，但在卵巢中的表達較精巢微弱[13]。目前，針對boule在海水養殖動物尤其是棘皮動物中的研究較少，其表達情況及作用機理尚不明確。

光棘球海膽Mesocentrotusnudus隸屬于棘皮動物門Echinodermata游在亞門Eleutherozea海膽綱Echinoidea正形目Camarodonta球海膽科Strongylocentrotidae，俗稱大連紫海膽，是西北太平洋沿岸水域較常見的經濟海膽類之一，也是中國北方沿海最主要的經濟種類之一[14]。光棘球海膽體型屬于大中型，性腺是其唯一可食用部分，成熟季節生殖腺呈淡黃色至橙黃色，質量好，富含不飽和脂肪酸[15]，營養價值高，適合于加工冰鮮海膽。本研究中，以光棘球海膽為研究對象，通過克隆獲得光棘球海膽boulecDNA序列全長，追蹤了boule在光棘球海膽組織、各時期性腺及早期胚胎發育過程中的表達情況，并通過切片原位雜交技術對boule基因在性腺細胞中的定位情況進行了分析，旨在為海膽生殖細胞的深入研究提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用光棘球海膽采自大連黃海海域(121°33′47″E，38°51′55″N)，直徑為(60.2±3.8)mm，濕體質量為(76.8±10.0)g。試驗開始前將海膽暫養于大連海洋大學農業農村部北方海水增養殖重點實驗室循環水槽，水溫為(12.41±0.11)℃，pH 為7.96±0.02，每兩天換水一次(換水量約30 L)，每天投喂一次海帶[16]。

試驗用去離子甲酰胺購自AMRESCO(美國)，DiethylPyrocarbonate(DEPC)購于Sigma-Aldrich?(上海)，馬來酸、Tween、20×SSC和PBS磷酸緩沖液粉末均購自索萊寶公司(北京)。

1.2 方法

1.2.1 組織總RNA的提取及cDNA的合成 解剖海膽，將所取組織樣品迅速置于液氮中速凍后保存于超低溫冰箱(-80 ℃)中備用。組織總RNA的提取按照SV Total RNA Isolation System(Promega Z3100)說明書進行，提取完畢后利用微量分光光度計Agilent 2100 Bioanalyzer (Aligent Technologies, Santa Clara, CA, USA)及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的濃度及完整性。然后取1 μg總RNA，按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech 634923)說明書操作建立cDNA文庫。總RNA的反轉錄參照PrimerScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa 634860)說明書進行。

1.2.2 cDNA全長克隆 在前期研究中，本實驗室獲得了光棘球海膽性腺轉錄組數據庫[17]，本研究中以人DAZL蛋白序列中保守的RRM結構域為查詢序列，查詢到了boule基因部分序列，設計5′和3′RACE引物(表1，設計網站：http://biotools. nubic.northwestern,edu/OligoCalc.html),并按照SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech 634923)說明書克隆boulecDNA全長。PCR擴增使用的酶為LA Taq酶(TaKaRa RR02MA)。擴增程序為：94 ℃下預變性2 min；94 ℃下循環變性30 s，55 ℃下退火復性30 s，72 ℃下延伸1 min，共進行35個循環；最后在72 ℃下再延伸10 min。PCR產物經過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將其切膠回收并純化，隨后連接至pMD18-T 載體并轉化入Trans5α感受態細胞中，搖床震蕩1 h后將其均勻涂布于LB培養基平板上，37 ℃下倒置過夜。次日，用滅菌牙簽挑取單菌落于盛有液體LB培養基的離心管中，搖床震蕩，菌落PCR篩選陽性克隆并測序。

表1 PCR所用引物Tab.1 Sequences of the primers used for PCR

1.2.3boule序列及系統進化分析 利用NCBI中ORF-Finder預測boule基因的開放閱讀框；使用SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)及ExPasy中的Protparam工具(https：//web.expasy. org/ protparam/)預測Boule蛋白的結構域和基本理化性質；使用Predict(Proteinhttps://www. predictprotein.org/)及Swiss-model(https：//swissmodel.expasy.org/)分析Boule蛋白的二級結構和三級結構；利用Clustal W進行多重序列比對，并用MEGA 7.0軟件對Boule氨基酸序列進行系統進化分析。

1.2.4 熒光定量PCR檢測基因表達 首先，取3只光棘球海膽，獲得腸、管足、體腔液、性腺的組織樣品。其次，考慮到boule基因在性腺中的表達量較高，本試驗中通過持續取樣，獲得處于不同發育時期包括恢復期(stage Ⅰ)、生長期(stage Ⅱ)、成熟前期(stage Ⅲ)和成熟期(stage Ⅳ)的性腺樣品。最后，通過催產并持續取樣，獲得光棘球海膽受精卵、4細胞期、8細胞期、16細胞期、囊胚、破膜期、棱柱幼蟲、四腕幼蟲和六腕幼蟲的胚胎樣品。

利用熒光定量PCR檢測各樣品的boule基因表達，每個樣品孔進行3次技術重復，熒光定量PCR試驗總體進行3次驗證。以Ubiquitin為內參基因，采用2-ΔΔCt方法計算boule基因在各組織、各時期性腺組織、各胚胎發育時期的表達情況。熒光定量PCR儀器為LightCycler?96(Roche)。PCR反應體系(共20 μL)包括：Fast Start Essential DNA Green Master 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA 2 μL，DEPC水 6.4 μL。PCR反應程序為：95 ℃下預變性10 min；95 ℃下循環變性15 s，60 ℃下退火復性60 s，共進行40個循環；95 ℃下反應10 s，65 ℃下反應60 s，97 ℃下反應1 s。

1.2.5 RNA探針合成 在boule的cDNA全長序列中設計引物，PCR擴增后將特異的目的片段用切膠回收的方式進行DNA純化，置于-20 ℃下備用。按照T7 RNA Polymerase(Roche，10881767001)和DIG RNA labeling mix(Roche，11277073910)說明書制備RNA探針，即在無酶微量離心管中配制PCR反應體系，PCR product or DNA 1 μg，DIG RNA Labeling Mix 1 μL，Transcription buffer 1 μL，T7酶 1 μL，RNAsein 0.5 μL，用DEPC水補足至總體積為10 μL，離心混勻后于37 ℃下反應2 h。完成后，加入1 μL DNA酶，37 ℃反應15 min，以消化剩余模板，反應結束后加入1 μL 0.2 mol/L EDTA終止消化，隨后加入預冷后的2.5 μL 4 mol/L LiCl和75 μL無水乙醇，-20 ℃下沉淀過夜。次日，在4 ℃條件下，以16 170×g離心15 min，再用體積分數為75%的無水乙醇洗滌兩次，最后加入25 μL DEPC水溶解RNA，并用微量分光光度計及瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA探針的濃度及質量。

1.2.6 RNA原位雜交 參照本實驗室以前的方法進行[18]。

1) 樣品處理。以光棘球海膽卵巢及精巢各時期的性腺樣品為試驗組，以光棘球海膽精巢生長期性腺樣品為對照組。將海膽性腺組織置于4%(體積分數)多聚甲醛中固定過夜；第2天，用DEPC-PBS搖洗3次，每次5 min，然后用300 g/L蔗糖-PBS溶液滲透過夜；第3天，使用冰凍包埋劑(OCT)進行包埋，包埋時注意組織方向；隨后用LeicaCM1900-1-1進行冷凍切片，切片完畢后，將玻片于37 ℃烤箱中烘烤1 h。

2) 固定。烘烤后的玻片置于盛滿DEPC-PBS的臥缸中復水，室溫搖洗2次，每次5 min，用4%(體積分數)多聚甲醛固定30 min后，再將玻片置于盛滿DEPC-PBS的臥缸中搖洗2次，每次5 min。

3) 雜交。在每個濕盒上平鋪3張濾紙，用濕盒緩沖液(20×SSC 2.5 mL、DEPC水22.5 mL、去離子甲酰胺25 mL)充分浸透濾紙，探針預變性(70 ℃，5 min)后，每個玻片上滴加200 μL雜交液，蓋上蓋玻片，用封口膜封住濕盒邊緣，置于60 ℃雜交箱中，雜交16～20 h。

4) 洗脫。配制洗脫液(20×SSC 12.5 mL、去離子甲酰胺125 mL、Tween 0.25 mL、無菌水112.5 mL)和0.2×SSC，預熱至63 ℃。將玻片浸入盛有洗脫液的臥缸，輕柔搖掉蓋玻片，63 ℃下搖洗2次，每次30 min；用0.2×SSC在63 ℃下搖洗2次，每次30 min；MABT室溫搖洗2次，每次30 min；隨后用封阻液(體積分數為10%的山羊血清+體積分數為90%的MABT)室溫封阻1 h；抗體孵育(體積分數為2%的山羊血清+體積分數為98%MABT+Anti-dig-body，抗體的使用比例為 1∶5 000)，4 ℃下過夜。

5) 顯色及鏡檢。用MABT室溫搖洗3次，每次5 min；用堿性磷酸酶顯色緩沖液室溫搖洗3次，每次5 min；按照說明書配制顯色液(碧云天，C3206)，避光顯色，顯色完成后， 用PBS室溫搖洗2次，每次5 min；然后進行甲醇梯度脫色(25%、50%、75%、100%、75%、50%、25%，均為體積分數)，每次5 min；再用PBS室溫搖洗2次，每次5 min，完成后甘油封片，并使用顯微鏡(Leica DM4B)拍照。

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS 23.0軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用Duncan法進行組間多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結果與分析

2.1 boule cDNA全長序列分析

本研究中，克隆得到boulecDNA全長序列為1 788 bp，其中，5′UTR為146 bp，3′UTR為601 bp，開放閱讀框(open reading frame，ORF)長度為1 041 bp，共編碼346個氨基酸。結構域預測結果表明，Boule蛋白具有一個進化上高度保守的RRM結構域(圖1)，Boule蛋白理論相對分子質量為38 070，理論等電點為7.84。Boule蛋白二級結構中包含27.46%的α -螺旋(Alpha helix，H)、13.58%的延伸鏈(Extended strand，E)和58.96%的無規則卷曲(Random coli，C)。將Boule蛋白以人的Dazl蛋白三維結構為模板(模板號：2xs5.1.A)進行同源建模，發現Boule蛋白在第39個氨基酸(右框)和第112個氨基酸(左框)處存在彎曲和延伸的β1、β4鏈，這種構象在不同物種的蛋白序列中十分保守，對于RNA識別至關重要(圖2)。Boule蛋白疏水殘基106個，親水殘基232個，親水殘基數大于疏水殘基數，為親水性蛋白。

加粗部分為起始和終止密碼子；畫線部分為RRM。 Bold part indicates the start codon and the stop codon;RRM is indicated by underlined part.圖1 光棘球海膽boule基因cDNA序列及預測的氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA and the deduced amino acid sequence of boule gene in the sea urchin Mesocentrotus nudus

黑色框架內代表的是以人Dazl蛋白為模板推測的Boule蛋白存在的β1、β4卷曲結構。Black frame represents the β1 and β4 coil structure of Boule protein based on human Dazl protein as template.圖2 Boule蛋白結構域預測及其蛋白三級結構預測Fig.2 Prediction of Boule protein domain and protein tertiary structure

2.2 多重序列比對和系統進化分析

用于多重序列比對物種及其Boule氨基酸序列在NCBI中的登錄號見表2。氨基酸序列比對結果，光棘球海膽與紫海膽StrongylocentrotuspurpuratusBoule氨基酸序列一致性最高，為66.48%，與長棘海星Acanthasterplanci的一致性達到43.26%，與其他脊椎動物如黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、虹鱒Oncorhynchusmykiss、大西洋鮭Salmosalar、原雞Gallusgallus和人Homosapiens的一致性較低，分別為22.83%、20.62%、30.45%、27.43%、29.55%(圖3(a))。光棘球海膽Boule蛋白具有一個進化上保守的RRM結構域，與紫海膽Boule氨基酸序列的一致性高達99.15%，與其他動物的一致性為41.53%～56.78%(圖3(b))。

表2 多重序列比對和系統進化樹所用的Boule信息

圖3 boule基因編碼的氨基酸多序列比對及結構域序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment and domain sequence alignment of amino acids encoded by the boule gene

基于以上試驗結果，利用MEGA7構建了Neighbor-joining(NJ)系統進化樹，結果顯示，光棘球海膽、紫海膽和長棘海星的Boule氨基酸序列聚為一支，基本符合物種親緣進化趨勢(圖4)。

圖4 Boule氨基酸序列的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of Boule amino acid sequences

2.3 boule基因的組織表達分析

在光棘球海膽生長期(stageⅡ)的腸、管足、體腔細胞、卵巢及精巢中，均檢測到了boule的表達，表達情況為精巢>卵巢>管足>腸>體腔液,其中，boule在精巢中表達量最高，且在精巢與卵巢中呈現差異表達，在精巢中的表達量約為卵巢中的25倍(圖5)。

圖5 boule基因的組織表達分析Fig.5 Expression of boule gene in adult tissues

2.4 boule基因在不同時期性腺中的動態表達分析

熒光定量PCR結果表明，boule基因表達量在卵巢中總體呈現上升趨勢，直至成熟期(stage Ⅳ)表達量最高；精巢中的boule表達量僅在生長期(stage Ⅱ)及成熟前期(stage Ⅲ)較高(圖6)。

*表示與卵巢恢復期有顯著性差異(P<0.05)。 * means significant difference compared with stage Ⅰ of the ovary(P<0.05).圖6 boule基因在不同性腺發育時期的動態表達分析Fig.6 Dynamic expression analysis of boule gene in different gonadal development stages

通過RNA切片原位雜交技術檢測boule基因在性腺細胞中的定位，結果顯示，僅在生長期及成熟前期的精巢中檢測到陽性細胞信號，其余時期未檢測到信號(圖7)。可能是由于表達量低、卵巢中的RNA不穩定及卵黃沉積等原因，并未在卵巢中檢測到明顯的陽性細胞信號。

NP—營養吞噬細胞；SC—精細胞；GC—生殖細胞。 NP—nutritive phagocyte；SC—sperm cell；GC—germ cell.圖7 切片原位雜交分析boule基因在精巢組織中的表達情況Fig.7 Expression of boule gene in testis by section in situ hybridization (SISH) analyses

2.5 boule基因在胚胎發育時期的表達特性分析

通過熒光定量PCR檢測發現：光棘球海膽胚胎發育過程中，在受精卵內檢測到大量boule轉錄本，由此說明boule為母源因子；隨著細胞的增殖與分化和胚胎發育過程的進行，boule基因表達量逐漸降低，直到棱柱幼蟲時期降到最低；從棱柱幼蟲時期開始，由于幼蟲開始變態及開始攝取餌料，boule基因表達量隨著幼蟲的發育，又呈現出逐漸升高的態勢(圖8)。

圖8 boule基因在胚胎發育時期的表達分析Fig.8 Expression of boule gene in embryonic development

3 討論

3.1 光棘球海膽boule基因序列全長及RRM結構域分析

本研究中克隆了光棘球海膽boulecDNA全長序列，預測出Boule蛋白存在一個結構與功能十分保守的RRM結構域，RRM結構域隸屬于RRM superfamily，包含兩段保守的序列，即RNP1和RNP2 (RNP: Ribonucleoprotein，核糖核蛋白)。RRM結構域是由DAZ基因家族編碼的RNA結合蛋白，在調控動物的生殖細胞分化與發育中發揮重要作用，為生殖細胞發育所必需。雖然不同物種間Boule氨基酸序列全長一致性較低(20.62%～66.48%)，但Boule的RRM結構域氨基酸序列比對一致性較高，尤其與紫海膽的一致性高達99.15%，boule基因的進化趨勢與光棘球海膽物種基本一致。

3.2 光棘球海膽boule基因在性腺中的表達情況

本研究中發現，不同于哺乳動物、果蠅等多種生物的boule僅在精巢或卵巢中特異表達，光棘球海膽中的boule在雌、雄性腺中均有表達，尤其是精巢中的表達量較高，這與櫛孔扇貝中boule的表達情況類似。此外，boule在腸、管足、體腔液中也有少量的表達，意味著boule不僅在生殖細胞發育過程中發揮作用，還可能有未知的生物學功能。

本研究中，通過追蹤boule在不同發育時期性腺中的表達情況，發現boule在精巢中的表達量高于卵巢，在生長期(stage Ⅱ)約為卵巢表達量的25倍，且在精巢生長期(stageⅡ)及成熟前期(stage Ⅲ)中的表達量最高。這種表達模式與紫海膽中的表達情況類似。在其他物種中，boule主要在精巢中表達，如boule基因特異地表達于果蠅的精巢，并參與調控果蠅的精子發生[7]。由此可以預測，boule可能參與調控光棘球海膽的精子發生過程。此外，本研究中還發現，boule基因的表達量隨著雌性光棘球海膽卵母細胞的發育成熟而逐漸升高，由此推測，boule基因可能與光棘球海膽卵母細胞的成熟有關。

3.3 光棘球海膽boule基因在早期胚胎發育過程中的表達情況

在脊椎動物中，作為蠑螈母源因子的dazl基因在早期胚胎發育過程中持續表達[19]，在硬骨魚中，牙鲆dazl基因在起始階段的表達量高于其他階段[20]；在無脊椎動物中，櫛孔扇貝合子基因開始表達前，boule的表達量變化不大，但當胚胎發育至原腸胚期時其表達量明顯增加[13]。這些均與本研究結果相似，因此，無論是無脊椎動物還是脊椎動物，boule在胚胎發育時期的表達模式均較相近，這表明boule在生殖細胞特化及形成中可能比較保守。

綜上所述，本研究中既完善了無脊椎動物中棘皮動物門動物生殖腺的生長發育，又開拓了生殖細胞的分化在非模式生物中的研究空間。以上結果也預示光棘球海膽boule基因可作為生殖細胞標記基因，可為生殖細胞相關的研究提供參考。

4 結論

1)boule基因包含一個進化上高度保守的RRM結構域，其可能在調控動物生殖細胞發育分化過程中發揮重要作用。

2)boule基因只在光棘球海膽的生殖細胞中高表達，且在雄性生殖細胞中特異表達，是雄性生殖細胞的標記基因，這為研究其精巢形成和分化、精子發生等過程提供了數據資料。

3) 整個胚胎發育時期均檢測到boule基因的持續表達，boule為母源因子，這為研究光棘球海膽生殖細胞特化及形成提供了數據支撐。