暗紋東方鲀leptin基因的克隆、SNP篩選及其與生長性狀的關聯分析

余云登，朱浩擁，王盛南，王耀輝，馬文超，楊曉，朱永祥，錢曉明，王秀利*

(1.大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧 大連 116023； 2.江蘇中洋集團，江蘇 海安 226600)

瘦素(Leptin)又稱OB蛋白，是由肥胖基因OB編碼的一類蛋白激素，OB基因最早由Zhang等[1]通過圖位克隆技術從小鼠脂肪組織中分離、克隆得到。哺乳動物的Leptin主要在白色脂肪組織(WAT)中合成，其受體廣泛表達于中樞和外周系統的組織中[2]，Leptin與這些特定受體結合調控動物的攝食[3-4]、脂質代謝[3]、血管生成[5]、骨骼重塑[6]、免疫[7]和繁殖[8]等重要生命活動。

哺乳動物的Leptin屬于長鏈螺旋細胞因子家族，其三維結構特征主要包括4個反向平行的α螺旋[9]。2005年，硬骨魚的leptin基因首次從紅鰭東方鲀Takifugurubripes[10]中克隆得到，之后還從多種硬骨魚中克隆和鑒定出了leptin基因。與哺乳動物不同，硬骨魚的leptin基因主要在肝臟中表達[10-11]，且哺乳動物的leptin只有一種，而已有研究表明，除鲀形目與部分鱸形目的種類只有一種leptin外，其他多數硬骨魚含有2種甚至4種leptin亞型[12]，不同亞型基因的空間表達有較大差異，表明這些亞型發揮的生理功能不同[13-15]。硬骨魚Leptin氨基酸序列與哺乳動物相比相似性較低，但三級結構十分保守，均包含4個α螺旋[10, 13-16]。與哺乳動物相似，硬骨魚的Leptin同樣是影響多種生物學功能的調控因子。在同源Leptin注射試驗[12, 16]及對魚體不同攝食狀態leptin基因表達量的檢測[13-16]中均顯示，leptin與抑制攝食有相關性。此外，leptin對硬骨魚的脂質也有調節作用[17]，但并不像在哺乳動物中一樣作為主要的脂肪抑制因子。在leptin對硬骨魚生殖影響的研究中發現leptin基因的表達與大西洋鮭Salmosalar及鯖Pneumatophorusjaponicus的精巢發育有關[18-19]；同源leptin能誘導雌性鯖魚的促性腺激素分泌[20]。但在對缺乏功能性leptin受體斑馬魚的研究中發現，受體缺失的斑馬魚并不會像leptin受體缺乏的小鼠一樣喪失生育能力，且未表現出食欲過高或肥胖[21]，這表明leptin在硬骨魚中的生理作用與哺乳動物相比有較大不同，還有待更進一步研究。

暗紋東方鲀Takifuguobscurus是中國特有的河鲀種類，屬于硬骨魚綱鲀形目鲀科東方鲀屬，主要分布于中國東、黃海沿海，還可進入長江并棲息于太湖，屬廣鹽性魚類，是著名的“長江三鮮”之一，具有較高的營養和經濟價值[22-24]。暗紋東方鲀和紅鰭東方鲀是中國養殖及食用范圍最廣的兩個河鲀品種[24]，但前者和后者相比有著生長速度慢的缺點[25]，這在一定程度上限制了暗紋東方鲀相關產業的發展。單核苷酸多態性 (single nucleotide polymorphism，SNP)是指生物不同個體 DNA 序列中單個核苷酸點突變產生的多態性[26]。SNP作為一種位點數量多、密度廣、遺傳多樣性高的分子標記，已被廣泛應用于與水產動物生長性狀相關的研究中[27-29]。本研究中，克隆了暗紋東方鲀東方鲀leptin基因cDNA序列，并基于leptin在硬骨魚生長發育過程中發揮的重要作用，通過直接測序篩選得到暗紋東方鲀leptin基因中分型穩定、多態性好的SNP位點，并與暗紋東方鲀生長性狀進行關聯分析，獲得與生長性狀顯著相關的位點作為暗紋東方鲀輔助育種的候選分子標記，以提高選育效率。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用暗紋東方鲀均來自江蘇中洋集團，隨機選擇6尾健康的3月齡幼魚作為基因克隆的試驗樣本；隨機選擇同期繁殖、同塘養殖的178 尾8月齡魚，測量其體質量、體長、體全長指標，剪取背鰭風干保存，作為SNP與生長性狀關聯分析的試驗樣本。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備 取6尾3月齡暗紋東方鲀幼魚，用 MS-222 麻醉后解剖，剪取肝臟組織經液氮低溫處理后于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存備用。

1.2.2 總RNA提取與cDNA第一鏈的合成 使用Trizol試劑(TaKaRa)進行總RNA提取，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測產物的完整性。使用Primer Script RT reagent Kit(TaKaRa)將總RNA反轉錄成cDNA,于超低溫冰箱(-80 ℃)中保存備用。

1.2.3leptincDNA克隆 參照NCBI數據庫中登錄的紅鰭東方鲀leptin基因mRNA序列信息(GenBank登錄號：NM_001032725.1)，設計包含紅鰭東方鲀蛋白編碼區(CDS)的1對引物(表1)，采用RT-PCR法克隆暗紋東方鲀的leptin基因。cDNA克隆的反應體系(25 μL)包含：10×PCR Buffer 2 μL，上、下游引物(mlep-F /mlep-R)各1 μL，Taq酶 0.5 μL，dNTP Mixture 2.5 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O 16 μL。PCR反應程序為：94 ℃下預變性5 min；94 ℃下變性30 s，60 ℃下退火復性30 s，72 ℃下延伸30 s，共進行35個循環；最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下保存。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后直接送北京六合華大基因科技有限公司測序。

1.2.4leptin基因序列分析 利用ORF Finder在線工具(https://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find. html)預測基因的開放閱讀框及其編碼的氨基酸序列；以預測的氨基酸序列在NCBI數據庫上進行同源比對，選取部分物種的Leptin氨基酸序列，利用MEGA Χ軟件構建系統進化樹；使用Expasy蛋白組服務器(https://www.expasy.org)中的Protparam分析Leptin蛋白的生理生化特征，用ProtScale預測其親疏水性，用PROSITE預測氨基酸序列功能域；使用Signal P4.1 Server(http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對Leptin蛋白信號肽進行分析；用SOPMA在線軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_ sopma.html)預測蛋白二級結構；用SWISS-MODEL(http: / /www.swissmodel.expasy. org)構建三維結構模型。

1.2.5 基因組DNA的提取與檢測 使用TIANamp Marine Animals DNA Kit(天根生化科技(北京)有限公司)提取暗紋東方鲀基因組DNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA質量并置于冰箱(-20 ℃)中保存待用。

1.2.6leptin基因的PCR擴增及突變位點基因分型 根據NCBI數據庫中紅鰭東方鲀的基因組數據(GenBank登錄號：NC_042293.1)設計1對引物(表1)，從178個暗紋東方鲀DNA樣本中隨機挑選24個樣本PCR擴增leptin基因的片段，通過比對測序結果篩選SNP位點。PCR反應體系(50 μL)包含：10×PCR Buffer 5 μL，上、下游引物(lep-F/lep-R )各2 μL，Taq酶 0.5 μL，dNTP Mixture 4 μL，暗紋東方鲀基因組DNA模板2 μL，ddH2O 34.5 μL。PCR反應程序為：94 ℃下預變性5 min；94 ℃下變性30 s，65 ℃下退火復性30 s，72 ℃下延伸30 s，共進行30個循環；最后在72 ℃下再延伸10 min，4 ℃下保存。PCR產物經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測后直接送北京六合華大基因科技有限公司測序。返回結果用seqMan軟件進行拼接比對后得到多態性高、分型穩定的突變位點，并與克隆得到的暗紋東方鲀cDNA序列及紅鰭東方鲀基因組數據(GenBank登錄號：NC_042293.1)比對確定基因結構。通過直接測序對178尾暗紋東方鲀leptin基因的突變位點進行分型。

1.3 數據處理

采用Popgene 32軟件計算有效等位基因數(Ne)、觀測雜合度(Ho)、期望雜合度(He)，并進行哈溫平衡檢驗(HWE)；采用PIC_CALC軟件計算SNP位點的多態信息含量(PIC)；采用Haploview軟件對leptin基因的SNP位點進行連鎖不平衡分析；采用SPSS 19.0軟件對篩選到的SNP位點與暗紋東方鲀的生長性狀進行關聯分析。

2 結果與分析

2.1 暗紋東方鲀leptin基因cDNA序列及推測的氨基酸序列結構

克隆得到的暗紋東方鲀leptincDNA序列長為661 bp，包括459 bp的開放閱讀框，共編碼152個氨基酸(圖1)，克隆序列已上傳至GenBank數據庫中(登錄號：MT832308)。推測的Leptin蛋白相對分子質量為19 948.69，等電點為6.90，不穩定值為28.31，親水性的總體平均值(GRAVY)為-0.089，結合ProtScale預測結果，推測該蛋白為親水的穩定蛋白。Leptin氨基酸序列含19個氨基酸的信號肽序列，功能位點包含1個N-豆蔻酰化位點、3個蛋白激酶C磷酸化位點和1個N-糖基化位點(圖1)。

推測的Leptin蛋白二級結構中α-螺旋(h)占 71.71%，β-折疊(e)占 2.63%，β-轉角(t)占 1.32%，無規卷曲(c)占 24.34%。使用SWISS-MODEL在線工具獲得Leptin蛋白的三級結構如圖2所示。

2.2 Leptin氨基酸序列比對及系統進化分析

同源性分析結果顯示：暗紋東方鲀Leptin氨基酸序列與紅鰭東方鲀的一致性最高，為96.71%；其次為菊黃東方鲀，一致性為93.42%；與其他不同種屬的魚類一致性較低，其中與草魚Leptin氨基酸序列的一致性僅為25.25%，而與其他脊椎動物的一致性則更低。基于魚類和其他脊椎動物Leptin氨基酸序列的系統進化樹顯示，進化樹可聚為魚類、鳥類、兩棲類和哺乳類4類，其中魚類中，草魚、鯉、鰱聚為一個分支，暗紋東方鲀、菊黃東方鲀、紅鰭東方鲀聚為另一個分支(圖3)。進化樹分析與傳統分類結果相一致。

2.3 leptin基因SNP位點的篩選

對24個暗紋東方鲀DNA樣本進行PCR擴增及測序，獲得了長度為691 bp的leptin基因片段，片段包括2個外顯子(外顯子2，外顯子3)及1個內含子(內含子2)。通過序列比對，在暗紋東方鲀leptin基因中篩選得到2個分型穩定的SNP位點：一個位于外顯子2(T24G)，為同義突變未改變氨基酸的編碼；另一個發生在內含子2(T193A)。本研究中，核酸位置以基因起始密碼子的第一個堿基為參考值1，統計所有178個序列，得到2個SNP的等位基因頻率和基因型頻率如表2所示。

表2 leptin基因2個SNP等位基因及基因型頻率

2.4 leptin基因SNP在暗紋東方鲀群體中的遺傳結構分析

統計2個突變位點的遺傳參數，結果如表3所示,其中，T24G中有效等位基因數Ne、觀測雜合度Ho、期望雜合度He、多態信息含量PIC數值均高于T193A，T24G是中度多態性位點(0.25≤PIC<0.5)，T193A位點是低度多態性位點(PIC<0.25)。經χ2檢驗，leptin基因的2個SNP在暗紋東方鲀群體中處于哈溫平衡狀態(P>0.05)。Haploview軟件的連鎖分析顯示，2個SNP間的r2為0.005，表明兩個位點彼此獨立。

表3 leptin基因SNP位點的遺傳參數Tab.3 Genetic parameters of SNP loci in leptin gene

2.5 leptin基因SNP與生長性狀的關聯分析

采用SPSS 19.0軟件分析不同基因型(頻率低于2.5%的基因型排除)與生長性狀的相關性，結果表明，T24G位點不同基因型個體間的體質量存在顯著性差異(P<0.05)，GG基因型個體體質量顯著小于TG和TT基因型(P<0.05)，為劣勢基因型(表4)。

表4 leptin基因SNP位點與生長性狀的關聯分析

將2個SNP位點的不同基因型進行組合，得到7種雙倍型，去除頻率低于2.5%的D3和D7，將其余5種與生長進行關聯分析(表5)，結果顯示，雙倍型D5的3個生長性狀值最高，體質量顯著高于D2、D4型個體(P<0.05)，極顯著高于D6型個體(P<0.01)，體長和體全長均顯著高于D6型個體(P<0.05)。

表5 leptin基因不同雙倍型與生長性狀的關聯分析Tab.5 Correlation analysis of different diplotypes of leptin gene and growth traits

3 討論

3.1 暗紋東方鲀leptin基因編碼的蛋白結構

本研究中,以近緣物種紅鰭東方鲀leptin基因的mRNA序列為參照，設計引物并擴增得到了暗紋東方鲀的leptincDNA。預測蛋白的三級結構模型顯示，暗紋東方鲀Leptin符合Leptin的基本特征，蛋白結構包含4個α螺旋。多物種Leptin氨基酸序列比對結果表明，物種間Leptin蛋白的一級結構存在較大差異，這表明物種間Leptin的功能存在較大差異。已有研究顯示，在哺乳動物中，Leptin是主要的脂肪抑制因子，但在硬骨魚中Leptin對脂肪穩態的調節并不明顯。Leptin受體缺失的斑馬魚并未表現出受體缺失小鼠食欲亢進、代謝提高和明顯肥胖的狀態。在硬骨魚中Leptin主要在葡萄糖的穩態調控中發揮作用，且調節葡萄糖的穩態似乎是硬骨魚和哺乳動物中的一種保守功能[21]。這可能與物種間Leptin相對穩定的三級結構有關。本研究中，同源性分析顯示，暗紋東方鲀Leptin氨基酸序列與同屬于東方鲀屬的紅鰭東方鲀和菊黃東方鲀序列的一致性較高，均在90%以上，這表明Leptin在東方鲀屬物種中的功能相對保守，而與其他硬骨魚、鳥類、兩棲類及哺乳類Leptin序列的一致性較低，這表明Leptin在進化過程中出現了較大變化。

3.2 暗紋東方鲀leptin基因SNP與生長關聯

本研究中，基于Leptin在硬骨魚生長發育中的重要作用，以leptin基因作為暗紋東方鲀生長性狀的候選基因，通過直接測序方法篩選到了2個分型穩定的SNP位點(T24G、T193A)。T24G位于編碼區發生同義突變，未改變氨基酸的編碼。但由于密碼子的偏好性[30]，突變的同義密碼子可能不是相應生物的最佳密碼子，甚至可能突變為低效密碼子。這可能會影響氨基酸的編碼效率，進而影響對應基因在生物中的功能發揮。本研究中關聯分析發現，T24G位點不同基因型個體間的體質量性狀存在顯著性差異(P<0.05)，GG基因型個體的平均體質量比TT基因型低9.22%，比TG基因型低11.63%，對暗紋東方鲀的生長不利，因此，可以通過篩除GG基因型提高暗紋東方鲀的生長性能。T193A位點發生于內含子，大多數SNP位點都發生在內含子，在人類基因組中內含子、外顯子及毗連的非翻譯區的SNP密度分別為8.21、5.288、7.51 SNP/10 kb[31]。內含子雖然不參與編碼氨基酸，但可通過影響轉錄速率和轉錄穩定性增加轉錄水平，此外，內含子還可以提高mRNA的翻譯效率[32]。已有的研究分別在大口黑鱸Micropterussalmoides[27]、紅鰭東方鲀[28]、草魚Ctenopharyngodonidella[29]等多種魚類基因的內含子中篩選到了與生長相關的SNP位點。T193A位點未顯現出明顯的生長性狀相關性，但單個SNP所含信息有限，不同的SNP位點間可能存在相互作用，將不同SNP位點組合成雙倍型能顯現更多基因頻率信息[27, 33]。本研究中，將T24G和T193A的不同基因型進行組合得到7種雙倍型，其中，D5型個體的體質量比D1、D2、D4、D6分別高出10.55%、16.32%、10.96%、22.55%，具有顯著的生長優勢。綜上所述，可將T24G位點的TG和TT基因型及雙倍型D5作為暗紋東方鲀輔助育種的候選分子標記。

4 結論

1) 使用反轉錄PCR技術克隆獲得了暗紋東方鲀leptincDNA序列長為691 bp。

2) 將暗紋東方鲀樣本PCR產物測序并比對篩選得到2個分型穩定的SNP位點。

3) 通過SPSS分析，T24G位點的TG和TT基因型及雙倍型D5是暗紋東方鲀優勢生長的基因型，可作為輔助育種的候選分子標記。