北方須鰍人工繁殖與胚胎發育研究

駱小年，段友健，郭童，嚴子微，李文康，吳晨

(大連海洋大學 水產與生命學院，遼寧 大連 116023)

北方須鰍Barbatulabarbatulanuda，俗稱花泥鰍、北方條鰍等，隸屬于鯉形目Cypriniformes鰍科Cobitidae條鰍亞科Nemachilinae須鰍屬Barbatula，在中國東北主要分布于鴨綠江、遼河、黑龍江上中游、烏蘇里江、松花江、嫩江、牡丹江、綏芬河、圖們江等水系。北方須鰍為山區溪流性小型魚類，雜食性，適應性強，因其肉質細嫩鮮美，深受消費者喜愛[1]。在遼寧東部山區，商品魚可達60～120元/kg，經濟價值較高，市場供不應求。然而，近年來，北方須鰍因過度捕撈導致其自然資源量急劇下降，為保護其物種資源和發展山區特色經濟，開展北方須鰍的規模化人工繁殖和增殖放流工作迫在眉睫。

目前，北方須鰍生物學特性已有研究[2-7]，其苗種生長最適蛋白質需求為40.72%[8]，且室內小水體養殖試驗獲得初步成功[9]，然而人工繁殖技術尚未見報道。經作者不斷探索，2015年北方須鰍繁殖初試獲得成功，2019年其規模化人工繁殖獲得成功，這為北方須鰍產業化發展奠定了堅實的基礎。本研究中，報道了北方須鰍人工繁殖與胚胎發育研究成果，旨在為其規模化人工增養殖技術提供指導。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用北方須鰍親魚，一部分購自本溪縣小市鎮野生魚交易市場，另一部分于太子河捕撈獲得，雌魚體質量為8.0～25.0 g，雄魚體質量為4.0～20.0 g。親魚運回后于養殖場車間室內暫養池暫養，暫養池規格為4.0 m×4.0 m×1.5 m，水深保持在0.8 m左右，用10 mg/L高錳酸鉀藥浴約15 min。

于2015年3—4月在遼寧省新賓滿族自治縣平頂山鎮漁場進行人工繁殖初試；于2016年3月—2019年4月在遼寧省桓仁滿族自治縣木盂子鎮漁場進行北方須鰍人工繁殖中試。

1.2 方法

1.2.1 雌雄鑒定及性成熟度鑒別 非生殖季節北方須鰍雌雄魚不易鑒別。生殖季節，雌魚個體明顯大于雄魚，腹部膨大柔軟，花紋不明顯，且生殖孔為水滴狀，紅腫外凸。卵巢發育成熟時，腹部膨大、飽滿，腹部形態類似泥鰍[10-11]，部分魚腹部透明，似有“透明窗”，能清晰觀察到卵巢內卵粒，輕微擠壓即有卵粒淌出；而雄魚腹部細長，有條紋狀紋路，生殖季節觸摸皮膚有粗糙感，生殖孔向內凹陷，呈箭頭狀，性成熟個體擠壓腹部有少量白色精液流出(圖1)。

1.2.2 催產藥物和適宜雌雄比例 催產藥物使用促黃體素釋放激素類似物2號(LHRH-A2)等混合催產藥物，用1 mL醫用注射器于背鰭基部肌肉一次注射，雄魚劑量為雌魚的1/2，每尾魚注射藥量為0.1～0.2 mL。為確定其最佳雌雄配比，設置5組梯度試驗，每組雌魚100尾，雄魚以10尾為基準遞增至50尾(即雌魚與雄魚的比例為100∶50、100∶40、100∶30、100∶20、100∶10)，每組設3個重復。

1.2.3 人工催情自然產卵試驗 在水族箱(1.0 m×0.5 m×0.4 m)中進行人工催產，產卵附著物設3類。其中，A組參照鯉Cyprinuscarpio催產方式[10]，水族箱中懸掛棕櫚魚巢，B組水族箱底部放置小石頭，C組水族箱底部放置河道細沙粒。每個水族箱放置已注射催產藥物的親魚30組，每組兩個重復。保持水溫為14～18 ℃，氣泵充氣增氧，溶氧為6 mg/L以上。同時進行繁殖適溫試驗，水溫9～21 ℃，設置7個梯度，每組間隔0.5 ℃，催產30組。出現交配現象時，通過壓擠腹部產卵的方式，統計每組雌魚成熟的數量。

1.2.4 人工授精 采用干法受精，至效應期，輕壓腹部檢查雌魚，如雌魚卵順利外流，即可進行人工授精。 為了方便操作，使用麻醉藥物乙二醇苯醚進行試驗效果對比，體積分數為0.1～0.2 mL/L。將雄魚解剖取出精巢，用0.75 mm的篩絹網布擠壓過濾，獲得精液，置于4 ℃冰壺內備用。卵粒收集完后，加入精液和少許質量分數為0.7%的生理鹽水攪拌，使精卵充分混合。加入與孵化溫度相同的清水，繼續攪拌約5 min后，倒掉多余的體腔液和精液，再漂洗2～3次，完成授精，進行脫黏或不脫黏孵化。

1.2.5 孵化

1)魚巢孵化。用棕櫚魚巢或0.83 mm的篩絹網布接卵，懸掛于室外水泥池中，靜水充氧，溶解氧始終保持在6 mg/L以上，每2 d換新水一次，每次換水1/3，直至破膜。

2)脫黏孵化。采用黃泥漿脫黏。受精卵置于錐形篩絹(0.245 mm)孵化簍內，孵化簍上端直徑為60 cm，高為20 cm，下部高為80 cm，最底部直徑為5 cm，底部包裹氣石，孵化過程中氣量大小以卵粒全部翻滾無死角為宜。每簍放卵25～30萬粒，在孵化過程中每隔0.5 h觀察一次箱體網眼通透情況，及時換箱或刷箱，保持水質清潔。遇有箱內魚卵水霉嚴重時，將卵倒出重新漂洗，直至清理完畢，孵化期間水溫保持在8.5～25 ℃。

3)胚胎發育觀察。采用奧林巴斯CX21型號顯微鏡在 4×10倍鏡下觀察。

4)適時下池(塘)。仔魚孵出3 d后，部分魚苗依附在篩絹網上，魚苗體色由透明逐漸變成灰黑色，當卵黃囊吸收一半以上，鰾充氣，消化道貫通，即可下池(塘)。

1.2.6 孵化效率評價

催產率：產卵魚數占催情魚總數的百分比。

受精率：原腸中期活卵數占產卵總數的百分比。

孵化率：魚苗水花數占受精卵總數的百分比。

2 結果與分析

2.1 北方須鰍人工催情自然產卵結果

注射催產藥物后，至效應時間，采用人工催產自然產卵試驗， A、B、C組水族箱中棕櫚魚巢、石頭及沙子上均未見北方須鰍魚卵，說明該方法不適宜北方須鰍人工繁殖接卵。

2.2 北方須鰍卵及魚苗的生物學特性

采用催情后人工授精的方法，北方須鰍親本在17～22 ℃水溫下，23～26 h到達效應時間。未受精的成熟卵為圓球形、淺黃色、具有彈性，卵徑為(2.15±0.07)mm，卵膜厚且堅韌，不透明；解剖取出精巢，研磨過濾后獲得精液，精液入水即散，鏡檢可見大量快速游動精子。

干法受精后，受精卵遇水產生黏性，卵膜吸水，卵周隙明顯擴大，卵徑可達(2.35±0.05)mm。北方須鰍產卵最低水溫為8.5 ℃，從卵受精到仔魚孵出需積溫66.67 ℃·d，至仔魚平游需積溫126.5 ℃·d。水溫為8～24 ℃，經98 h 54 min孵出，初孵仔魚全長為(4.9±0.8)mm，體質量為(0.6±0.1)mg，全身透明，仔魚卵黃囊大、側臥水底、少游動，隨著卵黃囊的吸收，身體漸長，活動能力加強，開始間歇在水體中下層活動，受到外界驚擾時，能迅速游開。

圖1 北方須鰍雌雄鑒別Fig.1 Gender discriminaion of loach Barbatula barbatula nuda

2.3 人工授精適宜雌雄比例

從圖2可見:不同雌雄比例情況下北方須鰍受精率存在顯著性差異(P<0.05)；隨著雄魚數量的增加，其受精率逐漸升高，當雄魚數量低于40尾時，受精率隨著雄魚數量的遞增而顯著增加(P<0.05)，而超過50尾后，其受精率無顯著性差異(P>0.05)。這表明，北方須鰍雌雄比例為2∶1時，受精率最高。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level, and the means with the same letter within the same column are not significant differences, et sequentia.圖2 雌雄比例對受精率的影響Fig.2 Effects of female to male ratio on fertilization rate

2.4 水溫對雌親魚成熟的影響

從圖3可見，注射催產藥物23 h后，隨著水溫從9 ℃升至17 ℃，順利擠出成熟卵粒的雌魚數量顯著增加(P<0.05)，水溫17 ℃時，親魚性腺成熟數量達到峰值，繼續升高水溫，成熟魚數量趨于穩定。因此，升溫至17 ℃有利于親魚集中產卵，此為提高催產效率的有效途徑。

圖3 注射催產藥物后水溫對雌魚性腺成熟的影響Fig.3 Effects of water temperature on ovary maturity after hormone injection

2.5 北方須鰍人工繁殖試驗

2.5.1 北方須鰍人工繁殖初試 于2015年3月28日至4月17日在遼寧新賓平頂山鎮進行了3批次北方須鰍人工繁殖試驗。從表1可見：共催產雌親魚630組，平均催產率為80.8%，平均受精率為84.7%，平均孵化率為51.1%，獲卵68.4萬粒，獲仔魚35.2萬尾；在水溫16～20 ℃條件下，一次注射，效應時間為23～26 h，可在室外水泥池內掛巢孵化，但孵化率均不超過40%，且孵化期較長，均達384 h以上，而室內孵化簍孵化，孵化率達88.5%，孵化期可縮短至98 h。

表1 2015年新賓滿族自治縣平頂山鎮漁場北方須鰍繁殖初試

2.5.2 北方須鰍繁殖中試 于2016—2019年在遼寧省桓仁滿族自治縣進行北方須鰍繁殖中試。從表2可見，中試共催產北方須鰍雌親魚55 000組，獲卵5 960萬粒，平均催產率為45.0%，平均受精率為56.0%，平均孵化率42.7%，獲水花1 840.3萬尾，其中2016年孵化受采用自然水溫(8～15 ℃)的影響，孵化率僅為35%，低于2017—2019年孵化率(人工控制水溫18～22 ℃)40%～55%，2017—2018年受麻醉藥物的影響，人工授精的受精率低于30%，遠低于2016、2019年的80%、85%。

表2 2016—2019年桓仁滿族自治縣木盂子鎮漁場北方須鰍繁殖中試

2.6 北方須鰍的胚胎發育情況

北方須鰍的胚胎發育過程可分為受精卵、胚盤形成、卵裂、囊胚、原腸、神經胚、器官分化和孵化出膜8個階段，根據胚胎形態特征的變化又可劃分為17時期。因達到各發育期的時間存在個體差異，將50%個體出現新特征作為發育時期的劃分標準，具體見表3和圖4。

表3 北方須鰍胚胎發育時序(2019年，水溫18～22 ℃)Tab.3 Embryonic development of loach Barbatula barbatula nuda (2019, water temperature of 18-22 ℃)

A—受精卵;B—胚盤形成; C—2細胞期；D—4細胞期;E—8細胞期;F—多細胞期;G—囊胚期;H—囊胚晚期;I—原腸早期;J—原腸中期;K—原腸晚期;L—神經胚期;M—眼囊期;N—尾芽期;O—肌肉效應期;P—出膜前期;Q—仔魚。A—fertilized egg; B—blastoderm; C—2 cell stage; D—4 cell stage; E—8 cell stage; F—multicellular stage; G—blastula stage; H—late blastula; I—early gastrula; J—middle gastrula; K—late gastrula; L—neurula; M—optic capsula stage; N—tail bud stage; O—muscular effect stage; P—prehatching stage; Q—larva.圖4 北方須鰍胚胎發育Fig.4 Embryonic development of loach Barbatula barbatula nuda

3 討論

3.1 北方須鰍產卵行為觀察

通過實地調查發現，北方須鰍通常晝伏夜出。繁殖期間北方須鰍將產卵場附近石頭、沙子、灰塵清理干凈，選擇河流較緩、硬底質的河床處產卵。產卵后親魚無護卵行為，卵粒較小，顏色灰白色，與河床砂礫相近，不易被敵害發現。人工催產至效應時間時，雌雄魚成對浮于水上層并排轉圈游動，類似于“雙人舞蹈”，產畢可見雌魚翻著白肚皮呈僵尸狀沉于底層。據觀察，北方須鰍的產卵行為與泥鰍不同，北方須鰍繁殖產卵時無泥鰍Misgurnusanguillicaudatus的纏繞產卵行為[12]。這可能與北方須鰍身體較短有關，不便于纏繞，而泥鰍體型修長，易于纏繞。北方須鰍卵的類型與同一流域的拉氏鱥Phoxinuslagowskii[13]、唇魚骨Hemibarbuslabeo[14]等一樣，均是黏性卵，在人為控制條件下，還未能自然產卵，推測可能是產卵條件還未達到其自然產卵的環境。在找到人工條件下北方須鰍自然產卵的限制因子之前，采用人工授精是實現北方須鰍繁殖的高效方法。

3.2 北方須鰍產卵時期的確定及人工產卵和孵化適宜溫度

本研究顯示，北方須鰍在遼寧新賓和桓仁的人工產卵時間在3月下旬—4月上旬(表1、表2)，這與實地觀察結果相一致。在新賓滿族自治縣平頂山鎮太子河主河段水溫為8.5 ℃時北方須鰍便開始產卵，最早繁殖期為3月28日前后，繁殖末期在4月15日左右。北方須鰍產卵最低水溫為8.5 ℃，遠低于泥鰍產卵最低產卵水溫(16 ℃)，這可能與不同種類間的繁殖策略差異有關，屬于北方須鰍對低溫環境的一種適應性特征。北方須鰍產卵期較早，北方河流冰雪融化后便開始繁殖活動，此時其他魚類尚未開始繁殖，敵害較少，這種孵育方式推測是北方須鰍這種魚卵卵徑小且仔魚較小的魚類對生存環境的一種生態適應。北方須鰍人工繁殖試驗表明，適宜北方須鰍孵化水溫在17 ℃以上，其原因是：首先，水溫高且恒定，則北方須鰍孵化周期短，與室外水泥池(水溫8～12 ℃)孵化大約需15 d相比，北方須鰍室內孵化簍孵化3～4 d即能破膜，從而也減少了胚胎死亡的機會；用孵化簍孵化方法能及時剔除死卵，保證孵化水質，其孵化率達50%以上，從而提高孵化效率，但其孵化率并未達80%以上，這可能與本試驗中使用自然河流中的野生親本有關。筆者認為，如果親本源自人工精心培育的親魚，其孵化效率會得到較大提高。

3.3 麻醉藥物對受精率的影響

為減輕魚類人工催產過程中親魚的損傷，藥物麻醉在魚類人工授精中得到越來越廣泛的應用[15-17]。由于北方須鰍個體小、體表黏液較多，麻醉藥物在北方須鰍催產上的應用同樣帶來較多的好處。經麻醉后的北方須鰍親魚在采卵授精時，其掙扎次數和強度明顯弱于未麻醉親魚，促使親魚采卵時間大為縮短，從而大大提高了操作效率，同時減少了親魚的損耗。但麻醉對受精率影響較大，未麻醉組受精率達80%以上，麻醉組受精率低于30%(表2)。Billard[18]認為，在授精稀釋液中麻醉劑(乙二醇苯醚)的體積分數大于0.05% 時才會影響精子的活力，且麻醉劑對人工授精時產生不利影響的概率較低。Wagner 等[19]研究認為，當MS-222麻醉藥物質量濃度在15～100 mg/L，丁香油質量濃度在10～100 mg/L，CO2質量濃度在50～173 mg/L時，活動精子的比例為68%～87%，不受麻醉的影響。然而，隨著麻醉藥質量濃度的增加，精子持續運動時間則減少，MS-222影響下精子運動的平均持續時間為55～36 s，丁香油影響下的平均持續時間為56～37 s，CO2影響下的精子運動持續時間較短(31～43 s)，表明麻醉藥在一定程度上影響受精率。本試驗中采用干法人工授精，拭干親魚體表帶有乙二醇苯醚的多余水分，但受精率仍然受到較大影響，推測造成這一因素的原因是北方須鰍屬小型無鱗魚類，藥物通過身體較快地吸收進入體液，從而影響了精巢，導致精子活力下降。綜上所述，北方須鰍在人工授精時，在未找到不影響精子活力的合適麻醉劑量平衡點之前，不建議使用麻醉藥物。

3.4 北方須鰍人工授精技術要點

鰍類人工催情后既可自然產卵也可采取人工授精，而北方須鰍目前僅能采取人工授精。綜合近幾年北方須鰍人工規模化繁殖試驗，可將其人工授精過程總結為“擠、剪、攪、撈、洗、放”6個字。

1)擠。輕輕擠壓雌魚腹部，將成熟的卵流淌至干凈的盆中。

2)剪。解剖雄魚取其精巢，置于0.75～0.96 mm篩絹網中擠壓使精液淌出，點滴至盆中卵上，用鵝毛攪動至均勻。

3)攪。盆中倒入清水，攪動受精，30 s后加入黃泥漿，攪動至受精卵的外膜上附一層薄薄的泥漿。

4)撈。在多數受精卵卵膜附有黃泥后，用撈網撈出受精卵放入裝有相近水溫的清水中進行吸水，吸水過程使受精卵變大，卵體表更具彈性。

5)洗。用清潔的水沖洗受精卵上的黃泥，同時用手不停地攪動，洗凈即可。

6)放。將受精卵洗干凈后，根據每個孵化簍的大小確定放卵量，用塑料量筒杯進行體積計量或稱重計量，后放入孵化簍中進行孵化。

3.5 北方須鰍胚胎發育特點

中國常見鰍科品種胚胎發育過程中(表4)，長薄鰍Leptobotiaelongata、中華沙鰍Botiasuperciliaris和花斑副沙鰍Parabotiafasciata為產漂流性卵魚類，其余均為產黏性卵魚類，其中，安氏高原鰍Triplophysaangeli和東方高原鰍Trilophysaorientalis魚卵為微黏性，北方須鰍為產強黏性卵魚類。泥鰍在水溫19～23 ℃條件下，40～60 min進入2細胞期，或在20 ℃條件下，1 h 38 min進入2細胞期；貝氏高原鰍進入2細胞期的時間較長，需4 h 20 min，但其孵化溫度較低，為9.0～12.8 ℃；而本試驗中的北方須鰍在水溫17～22 ℃條件下，進入2細胞期的時間需4 h。綜合溫度因素的影響，北方須鰍從受精卵進入卵裂所需時間最長，這可能與北方須鰍的胚胎發育特性及其在自然界中生存的環境有關。

表4 中國常見鰍科魚類的胚胎發育特征Tab.4 Embryonic developmental features of species in Cobitidae in China

3.6 北方須鰍繁殖成功的意義

土著經濟魚類是大自然賜予的寶貴種質資源庫，加強資源的保護開發利用研究，了解魚類資源的分布、洄游、繁衍等生物學特性，掌握高效、合理開發技術，提高科學管理水平，是漁業生產持續發展的重要保障。北方須鰍是遼河土著名優溪流性魚類，是遼寧省重要土著淡水魚類，開發前景廣闊[31]，其人工繁殖的成功，為北方須鰍產業化養殖奠定了堅實基礎，同時有助于推動中國水產養殖品種結構改善，對建設美麗鄉村具有重要意義。

4 結論

1)通過生態和生理調控措施，可實現野生北方須鰍的規模化人工繁殖。通過注射LHRH-A2等混合催產藥物催產北方須鰍雌親魚55 000組，獲卵5 960萬粒，平均催產率45.0%，平均受精率56.0%，平均孵化率42.7%，獲水花魚苗1 840.3萬尾。

2)在遼寧東部山區北方須鰍適宜繁殖季節主要集中在3月中旬至4月上旬。

3)北方須鰍產卵最低水溫8.5 ℃，適宜水溫17～22 ℃，在此溫度下，效應時間為23～26 h。

4)北方須鰍人工授精適宜雌雄比為2∶1。

5)將北方須鰍胚胎發育分為8個階段17個時期，受精卵吸水后卵徑為(2.35±0.05)mm，歷經胚盤形成期、卵裂期、囊胚期、原腸期、神經胚、器官分化期和出膜期。從受精至仔魚孵出需積溫為66.67 ℃·d，至仔魚平游需積溫為126.5 ℃·d。初孵仔魚全長為(4.9±0.8)mm，體質量為(0.6±0.1)mg。