南極魚(yú)類適應(yīng)低溫的分子進(jìn)化研究進(jìn)展

許強(qiáng)華，陳良標(biāo)

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)種質(zhì)資源挖掘與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306； 2.海洋生物科學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心，上海 201306； 3.大洋漁業(yè)資源可持續(xù)開(kāi)發(fā)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306)

圍繞南極洲的南大洋是地球上最冷的水域，從3 200萬(wàn)年前的漸新紀(jì)開(kāi)始，南極繞極流(the antarctic circumpolar current, ACC)就阻礙了南極海域與其他海域的熱量交流，導(dǎo)致南大洋(the Southern Ocean)的水溫逐步下降。在南極大陸架周圍的海水溫度常年維持在0 ℃以下，并被冰雪覆蓋。南極海域雖然寒冷，但也是海洋魚(yú)類分化最快的海域之一[1]。目前，在南極海域占主導(dǎo)地位的是隸屬于鱸形目的南極魚(yú)亞目Notothenioidei魚(yú)類,該亞目的魚(yú)類在南大洋變冷過(guò)程中快速分化，目前擁有8個(gè)科120多個(gè)物種，其中3個(gè)科(Bovichtidae、Pseudaphritidae和Eleginopidae)的絕大部分物種分布于南極圈外較溫暖的海域，而其余5個(gè)科(Nototheniidae、Artedidraconidae、Harpagiferidae、Bathy- draconidae和Channichthyidae)的101個(gè)物種則占據(jù)高緯度的冰凍海域[2]。

一般認(rèn)為，抗凍蛋白和其他抑制冰晶生長(zhǎng)的獨(dú)特蛋白的出現(xiàn)，以及浮力的變化為這些魚(yú)類向冰凍海域的分化及占據(jù)各種深度的水層奠定了基礎(chǔ)[2]。除了具有獨(dú)特的抗凍能力，其中冰魚(yú)科Channichthyidae的16個(gè)物種還丟失了血細(xì)胞中運(yùn)送氧氣和CO2的血紅蛋白，其血液完全透明。這些魚(yú)類的分子生理及與南極環(huán)境密切相關(guān)的進(jìn)化過(guò)程，為研究生命演化提供了一個(gè)獨(dú)特的窗口。南極魚(yú)類如何適應(yīng)長(zhǎng)期低溫和極端的光周期，是什么力量驅(qū)動(dòng)其快速進(jìn)化，在全球變暖的環(huán)境下它們的命運(yùn)又將會(huì)如何，這一系列問(wèn)題一直是極地生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。

迄今為止，鱗頭犬牙南極魚(yú)Dissostichusmawsoni、智利油南極魚(yú)Eleginopsmaclovinus、龍嘴雪冰魚(yú)Chionodracomyersi、扁嘴副帶腭魚(yú)Parachaenichthyscharcoti、革首南極魚(yú)Nototheniacoriiceps和鴨嘴裂頭冰魚(yú)Chaenocephalusaceratus等南極魚(yú)的基因組已經(jīng)全面測(cè)序和注釋[3-7]。最近多個(gè)南極亞目物種的全基因組序列如鞍斑杜父鱸Cottopercagobio、伯氏肩孔南極魚(yú)Trematomusbernacchii和尖頭裸龍?chǎng)孏ymnodracoacuticeps也開(kāi)始公布于公共網(wǎng)站(圖1)。研究者們通過(guò)與其他已知硬骨魚(yú)類的基因組信息進(jìn)行比較分析，南極魚(yú)類適應(yīng)極端環(huán)境的分子機(jī)制及基因組的進(jìn)化規(guī)律也逐步清晰起來(lái)。

物種名后的數(shù)為該物種基因組的大小，基于二代測(cè)序結(jié)果的物種未在圖中列出。The number followed by the species name indicates the genome size of the species, and the species sequenced by the second generation sequencing are not listed.圖1 已完成全基因組測(cè)序的南極亞目魚(yú)類物種的進(jìn)化關(guān)系及所屬的科名Fig.1 Phylogenetic relationships and family names among Notothenioidei fish species with accomplished whole genome sequencing

1 南極魚(yú)類成體和魚(yú)卵抗凍蛋白的種類、起源和結(jié)構(gòu)變異

由于魚(yú)類血液的冰點(diǎn)是-1 ℃左右，而南極海水的溫度常年在-2 ℃，能夠降低血液冰點(diǎn)的抗凍蛋白的存在被認(rèn)為是南極魚(yú)類得以向冰凍海域分化的基本前提[8]。目前在各種魚(yú)類中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少5種結(jié)構(gòu)不同卻都能抑制冰晶生長(zhǎng)從而降低體液冰點(diǎn)的蛋白，即抗凍蛋白[9]。在南極亞目魚(yú)類中發(fā)現(xiàn)的這類蛋白稱為抗凍糖蛋白(antifreeze glysoproteins, AFGPs)，其蛋白鏈?zhǔn)怯梢粋€(gè)被糖基化的三肽重復(fù)而成，重復(fù)次數(shù)從3次到60多次不等。該蛋白的命名方式傳統(tǒng)上是按照分子量從大到小，分別以AFGP1～AFGP8命名，分子量最小的是AFGP8。這些大小不一的AFGP的基因編碼序列一般會(huì)成串地聚在一起，分別由一個(gè)三肽L(I/N)F編碼序列分開(kāi)，蛋白質(zhì)翻譯后才將中間的三肽間隔子切除，從而形成大小不一但獨(dú)立編碼的抗凍蛋白分子。每個(gè)物種中通常含有多個(gè)這樣的多聚抗凍蛋白基因。一般來(lái)講，在更寒冷區(qū)域分布的南極魚(yú)體內(nèi)擁有更多拷貝數(shù)的抗凍蛋白基因，而生活在南極圈外的南極亞目魚(yú)類，只含有殘留的片段或者完全缺少抗凍蛋白[10]。另外，Cheng等[11]通過(guò)對(duì)這些基因序列分析發(fā)現(xiàn)，這些基因的5′UTR和 3′ UTR與廣泛存在于魚(yú)類及其他動(dòng)物體內(nèi)的胰蛋白酶基因的5′UTR和編碼序列高度同源。進(jìn)一步的序列進(jìn)化分析表明，抗凍蛋白基因起源于一個(gè)位于胰蛋白酶第一內(nèi)含子和第二外顯子交界處且具有TAA編碼能力的9個(gè)核苷酸，經(jīng)不斷擴(kuò)增后形成了一個(gè)AFGP-胰蛋白酶的嵌合體，這一嵌合體正是抗凍糖蛋白的最初雛形[11]。這種原始基因經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的擴(kuò)增和胰酶編碼序列的消除，形成了目前在基因組中可以看到的AFGP基因及基因家族。可見(jiàn)，南極魚(yú)類抗凍糖蛋白是從一段簡(jiǎn)單的、原來(lái)看似無(wú)用的短序列，通過(guò)不斷地?cái)U(kuò)增而形成的。有趣的是，北極鱈魚(yú)也具有分子結(jié)構(gòu)幾乎相同的抗凍糖蛋白，但是這些基因并不起源于胰蛋白酶，而是完全從頭起源[7，12]。短序列的擴(kuò)增和基因的擴(kuò)增是南北極兩種抗凍蛋白形成的共同機(jī)制。

在成年南極魚(yú)類體內(nèi)，抗凍糖蛋白會(huì)在胰腺外分泌組織中合成，并通過(guò)血液循環(huán)運(yùn)送至全身起到抗凍作用。然而，AFGP基因并不在卵細(xì)胞中原位表達(dá)。南極魚(yú)類的卵和早期胚胎是如何抗凍的，學(xué)者們對(duì)此開(kāi)展了相關(guān)研究。Chen等[13]通過(guò)對(duì)南極圈外和圈內(nèi)多物種的、基于基因芯片的比較基因組雜交分析發(fā)現(xiàn)，南極圈內(nèi)物種的卵殼蛋白基因家族發(fā)生了顯著的基因擴(kuò)增現(xiàn)象。對(duì)鱗頭犬牙南極魚(yú)的透明帶蛋白(zona pellucida protein，ZP)基因轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行的測(cè)序和分類，并結(jié)合比較基因組雜交的結(jié)果顯示，與溫帶魚(yú)類相比，有7種透明帶蛋白，包括ZPAX1、ZPAX2、ZPC1、ZPC3、ZPC4、ZPC5和ZPB的拷貝數(shù)在鱗頭犬牙南極魚(yú)中表現(xiàn)出顯著的擴(kuò)增。這些透明帶蛋白參與卵殼的形成，具有保護(hù)發(fā)育中胚胎的作用。研究還發(fā)現(xiàn)，南極魚(yú)類的透明帶蛋白與冰結(jié)合，在中等質(zhì)量濃度(4 mg/mL)條件下，可以非依數(shù)性地降低溶液的冰點(diǎn)和熔點(diǎn)，不同ZP種類降低冰點(diǎn)活性介于0.26～0.65 ℃，其中ZPAX1和ZPC5的活性最高，其降低冰點(diǎn)的活性超過(guò)相同濃度的AFGP蛋白[14](表1)。另外，轉(zhuǎn)入并表達(dá)南極魚(yú)科透明帶蛋白基因的斑馬魚(yú)卵表現(xiàn)出促進(jìn)冰晶融化的能力，且轉(zhuǎn)基因魚(yú)卵在冰凍環(huán)境下較野生對(duì)照魚(yú)卵的成活率顯著增高。通過(guò)對(duì)南極魚(yú)類透明帶蛋白ZPC5的突變分析發(fā)現(xiàn)，透明帶蛋白結(jié)構(gòu)域和表面的酸性殘基斑塊是促進(jìn)冰融化(ice melting-promoting，IMP)活性的基本結(jié)構(gòu)。因此，南極魚(yú)卵殼蛋白抗凍的機(jī)制與AFGP的抗凍機(jī)制并不相同，前者可以同時(shí)降低液體的熔點(diǎn)和冰點(diǎn)，而AFGP只降低冰點(diǎn)。AFGP只抑制冰晶生長(zhǎng)，而南極魚(yú)類的卵殼蛋白能促進(jìn)冰晶融化[15]。 最近破解的另一個(gè)南極亞目物種，鴨嘴裂頭冰魚(yú)的基因組表明，透明帶蛋白家族在鴨嘴裂頭冰魚(yú)基因組中廣泛擴(kuò)增，共鑒定到131個(gè)透明帶基因，包含20條contig上串聯(lián)重復(fù)的109個(gè)基因。其中一個(gè)位點(diǎn)就包含19個(gè)串聯(lián)重復(fù)的ZPC5基因[6],這個(gè)位點(diǎn)與其他南極亞目魚(yú)類并不一致，表明不同的物種具有不同透明帶基因的擴(kuò)增譜系。南極魚(yú)類透明帶蛋白擴(kuò)增和結(jié)構(gòu)特化的過(guò)程是一個(gè)極地環(huán)境推動(dòng)分子適應(yīng)性進(jìn)化的一個(gè)新的例證(圖2)。

表1 南極亞目魚(yú)類體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的抗凍蛋白種類和活性(引自Schrag等[14]和Cao等[15])

南極高寒區(qū)魚(yú)類通過(guò)透明帶蛋白(ZP)基因的擴(kuò)增和新功能化產(chǎn)生新型的抗凍蛋白，保護(hù)魚(yú)卵在冰凍環(huán)境下生存。By gene duplication and neofunctionalization，zona pellucida proteins(ZP) of the Antarctic high cold region fish evolve to become a new-type antifreeze protein，which could protect fish egg survive in frozen environment.圖2 具有抗凍能力的南極魚(yú)透明帶蛋白(ZP)Fig.2 Zona pellucida protein (ZP) with antifreeze activities in Antarctic fish

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)ZPC5結(jié)構(gòu)與抗凍功能的關(guān)系進(jìn)行了詳細(xì)研究。對(duì)體外表達(dá)的ZPC5蛋白的變性試驗(yàn)表明，南極魚(yú)ZPC5的抗凍功能依賴于其ZP結(jié)構(gòu)及其非聚合狀態(tài)[15]。但是，所有ZP蛋白的原始功能都是分泌到卵細(xì)胞外周，聚合形成卵殼。因此，ZP蛋白的抗凍功能與其原始結(jié)構(gòu)蛋白的功能存在著結(jié)構(gòu)性的沖突。Chao等[15]在鱗頭犬牙南極魚(yú)的基因組中至少鑒定到了3種編碼ZPC5變構(gòu)體的基因，除了原始ZPC5基因(包含10個(gè)外顯子)外，有2種ZPC5基因分別在第9和第10個(gè)外顯子中間引入了轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)，形成了C末端截?cái)嗔说腪PC5。抗凍功能檢測(cè)表明，C末端截?cái)嗟腪PC5容易留在細(xì)胞內(nèi)，并且不容易聚合，因此，其在冰凍狀態(tài)下保護(hù)細(xì)胞的功能更強(qiáng)[15]。而這種變構(gòu)體在其他南極魚(yú)類如鴨嘴裂頭冰魚(yú)的基因組中也存在，只是截?cái)嗟奈恢糜兴煌＿@種通過(guò)分子截?cái)喽苊夤δ軟_突的基因進(jìn)化機(jī)制，類似于極地綿鳚科魚(yú)類Ⅲ型抗凍蛋白從唾液酸合成酶起源的“避免適應(yīng)沖突”(escape from adaptive conflict)新基因起源的機(jī)制[16]。這也說(shuō)明，這種分子進(jìn)化機(jī)制存在普遍性。南極魚(yú)類透明帶蛋白基因的多樣性顯然與這些魚(yú)類的進(jìn)化歷史和產(chǎn)卵環(huán)境具有關(guān)聯(lián)性。透明帶蛋白基因在非南極亞目的其他極地魚(yú)類中擴(kuò)增的情況、結(jié)構(gòu)的變異及其與環(huán)境的關(guān)系是一個(gè)值得進(jìn)一步研究的問(wèn)題。

2 南極魚(yú)類血液發(fā)生和抗過(guò)氧化信號(hào)通路的特殊性和適應(yīng)性機(jī)制

環(huán)繞南極大陸的海洋是一個(gè)寒冷但溫度相對(duì)穩(wěn)定的水體，溫度的年變化幅度在-1.9～1 ℃之間。由于海水的氧溶解度與溫度成反比，南極海水處于氧飽和狀態(tài)。因此，生活在這里的南極亞目魚(yú)類表現(xiàn)出許多獨(dú)特的生理現(xiàn)象。一方面由于南極溫度低，南極魚(yú)類具有極低的新陳代謝率，因而對(duì)氧氣的需求量比較低；另一方面由于海水氧飽和度增加，南極魚(yú)類對(duì)運(yùn)氧能力的需求總體較弱。因此，大部分南極圈內(nèi)物種單位體積內(nèi)血紅細(xì)胞數(shù)量比溫帶魚(yú)類的血紅細(xì)胞數(shù)量明顯減少，而冰魚(yú)科的物種則完全失去了血紅蛋白，其原始性血紅細(xì)胞數(shù)量?jī)H為具有血紅蛋白的相同大小南極魚(yú)的1%左右[17]。最近對(duì)南極魚(yú)亞目物種基因組中的高度保守核苷酸片段(conserved nucleotide elements，CNEs)進(jìn)化模式的分析發(fā)現(xiàn)，那些調(diào)控血紅細(xì)胞發(fā)生相關(guān)基因的CNE在南極圈內(nèi)物種中存在著快速突變，表明它們?cè)陂L(zhǎng)期的低溫環(huán)境下具有功能丟失的趨勢(shì)[18]。這也說(shuō)明血紅細(xì)胞的發(fā)生(erythropoiesis)在南極亞目的魚(yú)類中受到了放松選擇。在血紅蛋白丟失的冰魚(yú)科物種中，除了CNE的放松選擇之外，其造血組織(頭腎)中的TGF-beta信號(hào)和p53明顯加強(qiáng)。強(qiáng)化的TGF-beta和p53信號(hào)通路促進(jìn)了90余個(gè)microRNAs的合成，包含眾多靶向調(diào)控GATA1、ALAS2等紅系發(fā)生關(guān)鍵調(diào)控因子的miRNAs，如miR-152、miR-1388、miR-16b。這幾個(gè)miRNAs表達(dá)量的提高可以降低斑馬魚(yú)胚胎血液的發(fā)生[19-20]。現(xiàn)有的研究表明，南極魚(yú)類對(duì)血紅細(xì)胞發(fā)生過(guò)程的調(diào)控是適應(yīng)低溫的一個(gè)重要機(jī)制。

轉(zhuǎn)錄組分析可以為長(zhǎng)期低溫下魚(yú)類的適應(yīng)機(jī)制探索提供指導(dǎo)。Chen等[13]對(duì)鱗頭犬牙南極魚(yú)的腦、肝、卵巢和頭腎4個(gè)組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并與溫帶/熱帶硬骨魚(yú)相同組織的轉(zhuǎn)錄組圖譜進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)許多與寒冷相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。這些上調(diào)的基因家族在蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)折疊和降解、脂質(zhì)代謝、抗氧化、抗凋亡、先天免疫、卵殼形成等方面發(fā)揮著重要作用。其中，蛋白質(zhì)生物合成、蛋白質(zhì)折疊和降解等保持蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)通路和諸多抗過(guò)氧化通路基因在基因表達(dá)上的變化尤其明顯。后續(xù)在其他物種中基于全基因組測(cè)序的比較發(fā)現(xiàn)，諸多抗氧化脅迫相關(guān)的基因發(fā)生了高表達(dá)或者擴(kuò)增，這些均為前期轉(zhuǎn)錄組研究提供了良好的例證。

在鴨嘴裂頭冰魚(yú)基因組中，與ROS穩(wěn)態(tài)相關(guān)的基因家族包括編碼超氧化物歧化酶(SOD)和NADPH醌受體氧化還原酶(NQO1)基因在鴨嘴裂頭冰魚(yú)基因組中均發(fā)生了擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)，鴨嘴裂頭冰魚(yú)有 5個(gè)SOD基因，其他鱸形目硬骨魚(yú)只有3個(gè)SOD。更可觀的變化是NQO1基因，鴨嘴裂頭冰魚(yú)中有33個(gè)NQO1基因，遠(yuǎn)多于大多數(shù)魚(yú)類基因組中2～10個(gè)NQO1基因的數(shù)量。另外，鴨嘴裂頭冰魚(yú)也是已完成基因組測(cè)序的硬骨魚(yú)中唯一具有兩個(gè)串聯(lián)拷貝的8-氧鳥(niǎo)嘌呤DNA糖基化酶(OGGL)的魚(yú)類。OGGL編碼的蛋白質(zhì)用于切除由于活性氧損傷而產(chǎn)生的修飾堿基，而在其他測(cè)序的硬骨魚(yú)基因組中只有一個(gè)OGGL拷貝[6]。

本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)鱗頭犬牙南極魚(yú)和智利油南極魚(yú)兩個(gè)分別位于南極圈內(nèi)和圈外不同地理位置的近緣南極魚(yú)物種12個(gè)主要組織的轉(zhuǎn)錄組比較中，同樣也發(fā)現(xiàn)了抗過(guò)氧化在適應(yīng)南極冰凍環(huán)境上的重要性。在差異基因富集的10多個(gè)生物學(xué)過(guò)程中，硒化合物代謝過(guò)程和硒半胱氨酸代謝過(guò)程得到了顯著富集，這兩個(gè)生物學(xué)過(guò)程均為抗活性氧途徑。與智利油南極魚(yú)相比，鱗頭犬牙南極魚(yú)組織中大部分含硒蛋白基因的轉(zhuǎn)錄活性有較大增強(qiáng)。與此相應(yīng)的，參與含硒半胱氨酸蛋白翻譯的基因在鱗頭犬牙南極魚(yú)中也顯著上調(diào)，轉(zhuǎn)運(yùn)Selcys的Selcys-tRNA基因家族也發(fā)生了極大擴(kuò)張。眾所周知，硒蛋白是細(xì)胞內(nèi)應(yīng)對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要分子，增強(qiáng)的抗活性氧能力是對(duì)持續(xù)寒冷環(huán)境的一種重要適應(yīng)。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4b(gpx4b)是一種唯一能夠減少脂質(zhì)過(guò)氧化氫的硒蛋白。該基因在鱗頭犬牙南極魚(yú)中表達(dá)較低，而與脂肪儲(chǔ)存相關(guān)的所有脂滴組裝蛋白(PLN2、PLN5、Fitm、Seipin)在該魚(yú)所有組織中均上調(diào)，這意味著鱗頭犬牙南極魚(yú)中存在抑制脂質(zhì)過(guò)氧化并向著脂滴儲(chǔ)存方向轉(zhuǎn)變的分子機(jī)制[7]。

目前，南極魚(yú)類血紅細(xì)胞的大幅降低是對(duì)低溫的適應(yīng)性進(jìn)化還是因?yàn)楦唢柡脱醐h(huán)境下的退化所致，迄今還是一個(gè)尚未解決的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)室從血紅細(xì)胞發(fā)生相關(guān)CNE的進(jìn)化研究發(fā)現(xiàn)，TGF-beta1及其受體在南極圈內(nèi)魚(yú)類發(fā)生的適應(yīng)性進(jìn)化，以及它們對(duì)紅系發(fā)生的抑制功能均暗示，血紅細(xì)胞的減少可能是一種適應(yīng)低溫的進(jìn)化過(guò)程。另外，低溫環(huán)境下抗氧化脅迫機(jī)制的高度提升，無(wú)論在有血紅蛋白和無(wú)血紅蛋白的物種中均是如此。這表明，抗過(guò)氧化機(jī)制的強(qiáng)化是魚(yú)類適應(yīng)長(zhǎng)期低溫的一個(gè)重要機(jī)制。這個(gè)發(fā)現(xiàn)對(duì)于抗低溫和抗高溫水產(chǎn)品種的選育具有重要意義。

3 南極魚(yú)類hepcidin基因家族的獨(dú)特進(jìn)化

Hepcidin是一種肝臟分泌的抗菌肽，由前體通過(guò)翻譯后剪切形成20～25個(gè)氨基酸殘基組成的短肽。在高等脊椎動(dòng)物中，hepcidin分子一般含有8個(gè)高度保守的半胱氨酸殘基，相互配對(duì)形成了四對(duì)二硫鍵構(gòu)成穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。Hepcidin是目前脊椎動(dòng)物上發(fā)現(xiàn)的唯一鐵離子代謝調(diào)節(jié)因子[21],其通過(guò)結(jié)合FPN1(ferroportin 1)發(fā)揮調(diào)控鐵穩(wěn)態(tài)的作用，而FPN1的作用是將鐵從十二指腸上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其他鐵輸出細(xì)胞輸出。Hepcidin在細(xì)胞表面與FPN 1結(jié)合，激活hepcidin-FPN1復(fù)合物的內(nèi)化，最終導(dǎo)致FPN1泛素化及蛋白復(fù)合物降解，從而降低細(xì)胞中鐵離子的輸出[22]。

研究表明，南極魚(yú)類的hepcidin由多個(gè)基因編碼，有的hepcidin分子發(fā)生了結(jié)構(gòu)性的改變。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，鱗頭犬牙南極魚(yú)和革首南極魚(yú)分別具有3種和5種不同的hepcidin cDNA，除了傳統(tǒng)的包含8個(gè)半胱氨酸(Cystein，Cys)殘基的保守的hepcidin外，還有一種只含4個(gè)半胱氨酸的hepcidin分子(4cys hepcidin)[23]。這種4Cys hepcidin分子的氨基酸序列幾乎與8Cys hepcidin的半胱氨酸沒(méi)有同源性，表明這類分子在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生了極大的改變，且這種4Cys hepcidin 基因只在南極圈內(nèi)的南極魚(yú)亞目魚(yú)類中檢測(cè)到。有趣的是，沒(méi)有血紅蛋白的冰魚(yú)科物種，如鴨嘴裂頭冰魚(yú)中只有8Cys的hepcidin而缺失4Cys hepcidin，造成這種缺失的原因目前尚不清楚。然而，在鱗頭犬牙南極魚(yú)的造血組織頭腎和脾臟中高表達(dá)但在鴨嘴裂頭冰魚(yú)體內(nèi)缺失的4Cys hepcidin，很可能與鴨嘴裂頭冰魚(yú)體內(nèi)血紅蛋白和造血作用缺失有關(guān)[23-24]。

這種新型4Cys hepcidin亞型的成熟區(qū)只包含4個(gè)半胱氨酸，只能形成2個(gè)二硫鍵。可以推測(cè)，其結(jié)構(gòu)可能在低溫下具有更高的靈活性[23]。南極綿鳚科魚(yú)類Lycodichthysdearborni并不屬于南極魚(yú)亞目魚(yú)類，但其同樣也生活在南極圈的冰凍水域中。在L.dearborni體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了獨(dú)立進(jìn)化而來(lái)的4Cys hepcidin同源基因，這支持了低溫驅(qū)動(dòng)半胱氨酸數(shù)目減少的hepcidin產(chǎn)生的假設(shè)。

為明確這種結(jié)構(gòu)變異的hepcidin分子是否具有與8Cys的hepcidin一樣的功能，近年來(lái)，本實(shí)驗(yàn)室在體外表達(dá)了南極魚(yú)類的3種hepcidin變構(gòu)體，其中包含2個(gè)具有8Cys和1個(gè)具有4Cys的hepcidin，并進(jìn)行了抑菌試驗(yàn)。結(jié)果表明，無(wú)論哪種hepcidin均能抑制細(xì)菌的增殖，其抑菌的活性濃度也相似。同樣地，這些hepcidin分子均能與FPN結(jié)合(未發(fā)表數(shù)據(jù))。鑒于鐵離子在細(xì)胞增殖、死亡、新陳代謝和心血管發(fā)育中不可替代的功能，對(duì)hepcidin基因家族在各物種中的組成、各種變構(gòu)體的功能差異及與環(huán)境因素的關(guān)系的闡明將為理解魚(yú)類的溫度適應(yīng)機(jī)制提供新的視角。

4 南極魚(yú)線粒體的適應(yīng)性進(jìn)化

革首南極魚(yú)是一種極地特有的硬骨魚(yú)，大量分布于南極近海岸水域。對(duì)革首南極魚(yú)基因組中進(jìn)化最快的10%的基因的GO富集分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)的富集項(xiàng)與線粒體相關(guān)。在發(fā)生正選擇的20個(gè)編碼線粒體蛋白中，有10個(gè)基因與氧化磷酸化直接相關(guān)，其中6個(gè)基因編碼ATP合成酶的亞單位，1個(gè)基因編碼線粒體復(fù)合物Ⅲ的亞單位，3個(gè)基因編碼線粒體復(fù)合物Ⅳ。這個(gè)結(jié)果提示，線粒體蛋白的快速進(jìn)化可能與寒冷環(huán)境的適應(yīng)相關(guān)。相比溫帶魚(yú)類，南極魚(yú)線粒體在氧消耗率、電子傳遞與ATP合成的耦合效率等方面對(duì)溫度更加敏感。它們的快速進(jìn)化可能影響南極魚(yú)類線粒體功能的熱敏感現(xiàn)象，并有助于解釋極地魚(yú)類正常代謝的極限溫度[25]。

沒(méi)有血紅蛋白的南極冰魚(yú)在線粒體上的改變更加明顯。對(duì)龍嘴雪冰魚(yú)與3種代表不同溫度環(huán)境的魚(yú)類(斑馬魚(yú)、尼羅羅非魚(yú)、三刺魚(yú))骨骼肌轉(zhuǎn)錄組比較和分析發(fā)現(xiàn)，龍嘴雪冰魚(yú)中參與各種線粒體過(guò)程的基因存在差異表達(dá)[5，26]。核糖體大小亞基的組裝是線粒體生成的必要條件，而在龍嘴雪冰魚(yú)中參與線粒體核糖體組裝的大部分輔酶基因發(fā)生了過(guò)表達(dá)。3種形成線粒體連接位點(diǎn)和嵴組織系統(tǒng)(MICOS)的蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本(包括MICOS核心組成IMMT)在龍嘴雪冰魚(yú)中顯著低表達(dá)。另外，線粒體肌酸激酶(mtCK)是連接內(nèi)部和外部的線粒體膜和促進(jìn)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移的相關(guān)蛋白質(zhì)，其在龍嘴雪冰魚(yú)骨骼肌中的表達(dá)也顯著降低。有試驗(yàn)表明，小鼠在敲除線粒體肌酸激酶mtCK 后，肌肉纖維發(fā)生超微結(jié)構(gòu)重塑，這導(dǎo)致線粒體的密度增高、體積增大[27]。這些表型與龍嘴雪冰魚(yú)肌肉細(xì)胞的表型一致。此外，在嵴重塑中起重要作用的OPA1及調(diào)節(jié)線粒體分裂的關(guān)鍵基因DNM1L/DRP1在龍嘴雪冰魚(yú)中均發(fā)生下調(diào)，而促進(jìn)線粒體融合和連接脂滴的MIGA1基因則在龍嘴雪冰魚(yú)中發(fā)生了上調(diào)。可以推測(cè)，這些變化使得龍嘴雪冰魚(yú)肌肉中含有更多數(shù)量的線粒體[28-29]。

事實(shí)上，從龍嘴雪冰魚(yú)和非南極物種的比較中得到的結(jié)果可以解釋為，龍嘴雪冰魚(yú)線粒體過(guò)程的基因差異表達(dá)在一定程度上可以反映出這是對(duì)南大洋冰凍條件的反應(yīng)，而不是因?yàn)槿狈\(yùn)氧載體——血紅蛋白。與其他具有血紅蛋白的南極魚(yú)相比，龍嘴雪冰魚(yú)基因組中擴(kuò)增的基因中，有大量的屬于線粒體蛋白組(IMPI)的基因。這種基因擴(kuò)增與其mRNA水平的高表達(dá)顯著相關(guān)，也與高組織特異性的功能特化顯著相關(guān)[5]。因此，基因擴(kuò)增也是南極冰魚(yú)體內(nèi)線粒體發(fā)生機(jī)制改變的進(jìn)化模式。

5 南極魚(yú)類的熱休克反應(yīng)

熱休克反應(yīng)是生物機(jī)體在熱應(yīng)激(或其他應(yīng)激)狀態(tài)下所表現(xiàn)的以基因表達(dá)變化為特征的防御適應(yīng)反應(yīng)，具體表現(xiàn)為一種或多種熱休克蛋白(heat-shock proteins，HSPs)表達(dá)的增強(qiáng)。長(zhǎng)期低溫且穩(wěn)定環(huán)境下進(jìn)化的南極魚(yú)類，其熱休克反應(yīng)發(fā)生了怎樣的變化，學(xué)者們對(duì)此開(kāi)展了相關(guān)研究。早期報(bào)道顯示，有的南極魚(yú)類如伯氏肩孔南極魚(yú)已經(jīng)失去了熱休克反應(yīng)的能力[30]。最近的基因組層面上的分析表明，所有種類的熱休克蛋白如HSP70、HSP90及HSP40等蛋白在極地魚(yú)類中均存在，而且有些熱休克蛋白如HSP70、HSP90的表達(dá)量比正常狀態(tài)下的溫帶魚(yú)類還要高[13]。這提示，低溫環(huán)境下蛋白折疊需要伴侶蛋白的協(xié)助。

研究發(fā)現(xiàn)，南極魚(yú)類中的熱激蛋白是組成性表達(dá)的，可能是為了緩解蛋白的冷變性[31-34]。革首南極魚(yú)的基因組草圖中，HSR(heat shock response)相關(guān)基因保存良好。在脊椎動(dòng)物中，HSF1(heat shock factor 1)被認(rèn)為是熱應(yīng)激的主要調(diào)節(jié)因子，而革首南極魚(yú)的HSF1失去了依賴磷酸化的小泛素相關(guān)修飾(phosphorylation-dependent sumoylation motif，PDSM)的基序，該基序是抑制其反式激活能力所必需的。PDSM中絲氨酸殘基的磷酸化是將小泛素修飾肽(small ubiquitin-related modifier peptide，SUMO)偶聯(lián)到HSF1中單個(gè)賴氨酸殘基的先決條件。當(dāng)需要最大化HSF1活性時(shí)，去泛素化酶從HSF1中去除這種修飾。革首南極魚(yú)和一些冰魚(yú)的HSF1在調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域中不包含完整的PDSM，并且其PDSM的絲氨酸殘基被天冬酰胺取代。因此，革首南極魚(yú)的HSF1不被類泛素化降解，這意味著HSP1的反式激活不受類泛素化作用的抑制。在革首南極魚(yú)基因組背景下，失去SUMO位點(diǎn)的PDSM會(huì)通過(guò)簡(jiǎn)單的模式最大限度地激活對(duì)熱應(yīng)激的反應(yīng)[35-36]。與伯氏肩孔南極魚(yú)不同的是，革首南極魚(yú)中的HSR在全血轉(zhuǎn)錄組水平上保留了增加熱應(yīng)激蛋白(HSP70、HSP ssb1、HSP40)的表達(dá)能力，以響應(yīng)急性熱應(yīng)激[3]。因此，極地魚(yú)類的HSR反應(yīng)具有物種特異性。

6 南極魚(yú)類中性浮力的獲得

魚(yú)鰾是大多數(shù)硬骨魚(yú)的主要浮力器官，而所有的南極亞目魚(yú)類都沒(méi)有魚(yú)鰾。與底棲祖先(如智利油南極魚(yú))顯著不同，有些物種在進(jìn)化上再次獲得了中性或接近中性的浮力，使它們能填充海洋中上層水域的生態(tài)位，成為南極亞目適應(yīng)輻射的一個(gè)獨(dú)特標(biāo)志。鱗頭犬牙南極魚(yú)是少數(shù)獲得了中性浮力的物種之一。研究表明，這個(gè)物種通過(guò)皮下和肌肉中廣泛的脂質(zhì)(主要是甘油三酯)沉積，以及主要由軟骨和少量礦化骨組成的輕質(zhì)骨骼，降低整體密度，在海水中提供靜態(tài)升力[37]。轉(zhuǎn)錄組分析表明，與智利油南極魚(yú)相比，鱗頭犬牙南極魚(yú)肌肉中參與三酰甘油合成的酶轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，包括關(guān)鍵的酰基甘油-3-磷酸O-酰基轉(zhuǎn)移酶亞型和胞苷二磷酸-二酰甘油合成酶。同時(shí)，與脂肪儲(chǔ)存調(diào)控相關(guān)的基因除MEST基因外表達(dá)量均顯著增高。相反地，鱗頭犬牙南極魚(yú)肌肉中與脂質(zhì)β-氧化相關(guān)的基因卻顯著下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明，相對(duì)于智利油南極魚(yú)，鱗頭犬牙南極魚(yú)肌肉的代謝途徑從脂質(zhì)分解轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)生物合成和脂質(zhì)儲(chǔ)存，有利于脂質(zhì)的沉積，從而有助于中性浮力的形成。KEGG進(jìn)一步分析表明，肌肉中脂肪代謝的改變是通過(guò)脂肪合成的主要調(diào)控因子PPARγ實(shí)現(xiàn) (圖3)。 在這條通路上，一些促進(jìn)PPARγ功能的因子如ID2、METRN1、STK3、CREB1和SNAI2等被大量表達(dá)，這些基因的大量表達(dá)促進(jìn)了脂肪細(xì)胞的生成[7]。

鱗頭犬牙南極魚(yú)肌肉組織中PPARγ和10個(gè)促進(jìn)脂肪細(xì)胞生成的基因(紅框表示)表達(dá)比祖先物種均顯著提高，而抑制脂肪合成的因子只發(fā)現(xiàn)1個(gè) TGFB1(藍(lán)框)(引自Chen等[7]，2019)。PPARγ and other 10 genes that promote the production of fat cells (red box) show significantly up-regulated expressions in muscle tissues of the Antarctic fish D.mawsoni， compared with its ancestor species.Only one gene TGFB1 (blue box) that inhibits fat synthesis is found(Cited from Chen et al.[7]，2019).圖3 鱗頭犬牙南極魚(yú)脂肪細(xì)胞生成的基因調(diào)控Fig.3 Gene regulations of adipose cell generation of the Antarctic fish Dissostichus mawsoni

在骨化方面，脊椎動(dòng)物骨骼發(fā)育的兩個(gè)主要調(diào)節(jié)因子Sox9和Runx2的表達(dá)在鱗頭犬牙南極魚(yú)、伯氏肩孔南極魚(yú)和博氏南冰鰧Pagotheniaborchgrevinki的盆骨帶骨轉(zhuǎn)錄組中無(wú)明顯變化。然而，許多BMP通路、Wnt通路基因的表達(dá)和許多已知參與這一過(guò)程的調(diào)節(jié)因子的表達(dá)在鱗頭犬牙南極魚(yú)中發(fā)生了特異性改變，這可能改變了軟骨形成和成骨之間的發(fā)育平衡[7]。在這些高度上調(diào)的基因中，結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF與早期的成骨分化有關(guān)，包括成骨前體細(xì)胞的增殖和募集；但當(dāng)CTGF組成性表達(dá)時(shí)，其會(huì)抑制Wnt-3A和BMP-9誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化[25]。另外，前列腺素過(guò)氧化物合成酶2(HSPG2)是滑膜間充質(zhì)細(xì)胞向軟骨和成脂分化所必需的，其通過(guò)調(diào)節(jié)Sox9和PPARγ促使細(xì)胞外基質(zhì)蛋白1(ECM1)與HSPG2相互作用調(diào)節(jié)軟骨形成。MEF2C是一種調(diào)節(jié)肌肉和心血管發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)激活軟骨細(xì)胞肥大的遺傳程序來(lái)控制骨的發(fā)育[38]。目前已知一些基因的上調(diào)可以抑制成骨細(xì)胞的形成，如TOB2[39]、CTNNBIP1[40]、分泌型卷曲相關(guān)蛋白1(secreted frizzled-related protein 1,SRFP1)[41]和ZBTB16[42]；而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族的一些成員(BMPR1A、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、Smad1)可促進(jìn)軟骨形成和成骨細(xì)胞形成。這些基因在鱗頭犬牙南極魚(yú)骨骼中的表達(dá)發(fā)生顯著變化。CYR61和PTN特異性地促進(jìn)成骨細(xì)胞的形成[43-44]，但PTN的表達(dá)在鱗頭犬牙南極魚(yú)骨骼中顯著減少，這與減少硬骨的形成是一致的。另外，一些基因通過(guò)調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞生成來(lái)影響骨化，如Sbno2可促進(jìn)破骨細(xì)胞融合[45]，成骨細(xì)胞上EphA2信號(hào)的激活導(dǎo)致骨的重吸收。鱗頭犬牙南極魚(yú)骨骼的基因表達(dá)模式顯示，在骨骼發(fā)育過(guò)程中，基因表達(dá)有利于軟骨生成而不是成骨細(xì)胞生成，這將降低骨密度，并有助于實(shí)現(xiàn)中性浮力 (圖4)。因此，南極魚(yú)基因組和轉(zhuǎn)錄組的比較研究，為揭示極地魚(yú)類中性浮力形成的分子發(fā)育機(jī)制指明了新的方向。

鱗頭犬牙南極魚(yú)骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析表明，與溫帶祖先物種相比，其促進(jìn)軟骨生成的因子(深灰框)、抑制軟骨分化成骨細(xì)胞的因子(籃框)和促破骨因子(紅框)均顯著高表達(dá)，而促進(jìn)成骨細(xì)胞生成的因子(綠框)則顯著低表達(dá)。The Antarctic fish D.mawsoni osteocyte transcriptome analysis indicates that factors that promote chondrogenesis (dark gray box)，and genes that inhibit osteogenesis (blue box)，and osteoclastic factors (red box) show significantly up-regulation compared with its ancestor species.圖4 基因表達(dá)的變化促使鱗頭犬牙南極魚(yú)非鈣化軟骨的生成[7]Fig.4 Gene expression changes promote non-calcifiedchondrogenesis in the Antarctic fish Dissostichus mawsoni[7]

7 低溫驅(qū)動(dòng)的魚(yú)類基因組進(jìn)化趨勢(shì)

極地魚(yú)類為人們了解環(huán)境溫度與基因組GC含量和蛋白質(zhì)的氨基酸偏好提供了機(jī)會(huì)。對(duì)基因組總體CG含量的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，南極亞目魚(yú)類的基因組與溫帶魚(yú)類無(wú)明顯差異，均在40%左右[7，46]，但在氨基酸密碼子的使用頻率上，冷水魚(yú)和熱帶魚(yú)表現(xiàn)出密碼子替換的不對(duì)稱性。與熱帶魚(yú)相比，冷水魚(yú)在同義和非同義密碼子替換中均表現(xiàn)出對(duì)GC的偏好。溫帶魚(yú)類也偏愛(ài)富含GC密碼子的氨基酸，而不傾向于那些富含AT密碼子的氨基酸。寒帶魚(yú)富含GC密碼子的非同義替換傾向于在蛋白質(zhì)鏈中增加小分子量的氨基酸比例。對(duì)蛋白質(zhì)組二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)和比較研究表明，寒帶魚(yú)類蛋白質(zhì)組中隨機(jī)卷曲的頻率明顯高于熱帶魚(yú)類。這種替代的偏向性可以增加蛋白質(zhì)的靈活性，對(duì)降低低溫環(huán)境下蛋白酶的活化能是有利的[47]。

一系列的研究發(fā)現(xiàn)，生活于南大洋不同溫度區(qū)間的南極亞目魚(yú)類的基因組大小存在明顯差異，那些生活于高緯度冰凍海域的南極魚(yú)物種具有更大的基因組。基因組變大的現(xiàn)象在血紅蛋白丟失的冰魚(yú)科物種中特別明顯，其基因組比低緯度寒溫帶海域進(jìn)化上比較原始的物種大30%～50%[48]。南極亞目魚(yú)類未發(fā)生過(guò)種類特異的全基因組加倍的事件。高緯度冰凍海域物種基因組的增大主要是轉(zhuǎn)座子大量擴(kuò)增導(dǎo)致的[6-7]。對(duì)鱗頭犬牙南極魚(yú)基因組與溫帶南極亞目物種的比較基因組雜交發(fā)現(xiàn)，有17個(gè)編碼逆轉(zhuǎn)錄酶和內(nèi)切酶基因顯示出8～300倍南極圈內(nèi)物種特有的重復(fù)[13]。除了轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增外，很多蛋白的編碼基因也發(fā)生了擴(kuò)增。Chen等[7]通過(guò)基于芯片的比較基因組雜交發(fā)現(xiàn)，118個(gè)基因家族在南極魚(yú)物種中表現(xiàn)出明顯的擴(kuò)增，其中包括AFGP基因家族、ZP基因家族、Lectin基因家族、Selcys-tRNA基因及與線粒體相關(guān)的基因。對(duì)這些擴(kuò)增基因的功能研究表明，這些擴(kuò)增基因是對(duì)極地冰凍環(huán)境適應(yīng)的重要遺傳基礎(chǔ)[5，13，15，26]。可以推測(cè)，對(duì)極地魚(yú)類中擴(kuò)增基因種類和功能的深入探索是發(fā)現(xiàn)抗凍或者抗低溫性狀決定基因的有效途徑。

是什么因素促進(jìn)了南極亞目魚(yú)類轉(zhuǎn)座子活性的增加，從而導(dǎo)致基因組變大，這是一個(gè)尚未解決的問(wèn)題。一般認(rèn)為，環(huán)境脅迫如極端溫度、氧化脅迫、輻射等因素往往導(dǎo)致轉(zhuǎn)座子抑制機(jī)制，如DNA甲基化或組蛋白修飾等表觀遺傳因素的改變，從而使轉(zhuǎn)座子重新回到活躍狀態(tài)[49-50]。南極魚(yú)類轉(zhuǎn)座子的擴(kuò)增是否與低溫脅迫有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)此開(kāi)展了詳細(xì)研究。通過(guò)對(duì)鱗頭犬牙南極魚(yú)基因組中長(zhǎng)散在重復(fù)序列(LINE-1)擴(kuò)增時(shí)間的計(jì)算發(fā)現(xiàn)，這些序列的大量擴(kuò)增發(fā)生在6百萬(wàn)年前當(dāng)極地海洋的溫度降到最低點(diǎn)的時(shí)候(圖5)。為進(jìn)一步研究LINE擴(kuò)增與低溫的關(guān)系，將來(lái)源于鱗頭犬牙南極魚(yú)的一個(gè)長(zhǎng)散在重復(fù)序列(DmL1)進(jìn)行了克隆并轉(zhuǎn)染人類和魚(yú)類的細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫刺激下兩種細(xì)胞基因組中DmL1的拷貝數(shù)均有所增加。而進(jìn)一步研究揭示，在冷脅迫條件下，正是由于活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積累激活了絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/p38信號(hào)通路，并進(jìn)而引起dmL1轉(zhuǎn)座活性的增加[51]。由于MAPK/p38信號(hào)通路普遍參與動(dòng)物的應(yīng)激反應(yīng)，這種機(jī)制很可能普遍存在于動(dòng)物中。顯然，MAPK通路如何激活LINE-1類的逆轉(zhuǎn)座活性，而南極魚(yú)類高漲的逆轉(zhuǎn)座活性如何得到有效控制從而保持基因組的穩(wěn)定，是基因組進(jìn)化領(lǐng)域一個(gè)值得研究的問(wèn)題。

圖5 鱗頭犬牙南極魚(yú)、智利油南極魚(yú)LINE-1擴(kuò)增與溫度下降的關(guān)系[7]Fig.5 Correlations between LINE1 duplications and the cooling temperature in Antarctic fishes Dissostichus mawsoni and Eleginops maclovinus[7]

8 存在問(wèn)題及展望

隨著各種組學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，近10多年來(lái)，極地魚(yú)類對(duì)低溫環(huán)境生理適應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)正在得到揭示。人們已經(jīng)在抗凍和多種組織如血液、骨骼、脂肪等特殊的發(fā)育調(diào)控有了新的認(rèn)識(shí)。在細(xì)胞生理學(xué)的水平上，以蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持和抗過(guò)氧化為特征的抗逆信號(hào)通路也被揭示是極地魚(yú)類抵抗寒冷環(huán)境的重要通路。然而，對(duì)魚(yú)類抵抗低溫的分子機(jī)制的深入了解有賴于擴(kuò)展到與其他溫度區(qū)間的魚(yú)類進(jìn)行更深入的比較研究。目前，在極地魚(yú)類中所揭示的抗凍蛋白及抵抗過(guò)氧化等的分子都是處于低溫信號(hào)傳遞鏈的末端分子，是否在魚(yú)類中存在低溫感應(yīng)的關(guān)鍵基因或節(jié)點(diǎn)基因還有待進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)室和其他一些實(shí)驗(yàn)室對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行的低溫應(yīng)激下多組織轉(zhuǎn)錄組的分析表明，斑馬魚(yú)成體各組織中存在復(fù)雜的低溫響應(yīng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中JUN和BCL6a在低溫網(wǎng)絡(luò)中處于節(jié)點(diǎn)的位置[52]。JUN和BCL6a結(jié)合位點(diǎn)在各溫度區(qū)間的魚(yú)類物種基因組上的豐度也呈現(xiàn)出與所處溫度范圍相對(duì)應(yīng)的現(xiàn)象[52]。JUN的激活受到JNK、P38等MAPK通路激酶的調(diào)控，因此，MAPK通路在魚(yú)類低溫應(yīng)激中占據(jù)重要位置，這在多種魚(yú)類的低溫應(yīng)激網(wǎng)絡(luò)中已得到證明[53-54]。進(jìn)一步來(lái)說(shuō)，細(xì)胞內(nèi)的MAPK通路與其他重要的通路如TGF-beta等也有復(fù)雜的聯(lián)系。可以預(yù)見(jiàn)的是，這些重要通路聯(lián)合起來(lái)共同決定魚(yú)類的溫度適應(yīng)范圍。然而，目前在這些通路中，由哪些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因控制魚(yú)類對(duì)溫度的適應(yīng)范圍還遠(yuǎn)未明確。另外，魚(yú)類究竟如何感應(yīng)溫度，它們的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)存在的TRP類離子通道是否與其他動(dòng)物一樣感應(yīng)溫度，它們?cè)诘蜏匦盘?hào)的傳導(dǎo)上，對(duì)已經(jīng)確定魚(yú)類的溫度適應(yīng)范圍上扮演什么角色，這些問(wèn)題還有待深入研究。

根據(jù)目前對(duì)南極魚(yú)類適應(yīng)低溫的分子進(jìn)化研究情況，作者提出今后在魚(yú)類適應(yīng)低溫和進(jìn)化機(jī)制領(lǐng)域上有待深入開(kāi)展研究的科學(xué)問(wèn)題及研究方向有：

1)在極地魚(yú)類低溫適應(yīng)的復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中，起關(guān)鍵作用的分子是什么，這些關(guān)鍵分子或者調(diào)控序列是在南極環(huán)境下新產(chǎn)生的，還是在原有的分子基礎(chǔ)上加以改進(jìn)而產(chǎn)生的。

2)極地魚(yú)類分子水平的微進(jìn)化如何促成物種水平的快速分化使南極亞目魚(yú)類成為快速分化的海洋魚(yú)類的典型代表。

3)在全球變暖的背景下，這些極地魚(yú)類的命運(yùn)將會(huì)如何，什么樣的分子或者生物學(xué)途徑可以預(yù)測(cè)各物種的最高耐受溫度。

4)在深入研究這些科學(xué)問(wèn)題的基礎(chǔ)上，利用從南極魚(yú)類中挖掘出來(lái)的獨(dú)特和高效的抗逆基因，為魚(yú)類抗逆育種或器官和細(xì)胞的低溫保存服務(wù)的研究也將是本領(lǐng)域今后的重要研究方向。對(duì)極地生命過(guò)程的深入研究將使人們更深地了解有關(guān)環(huán)境適應(yīng)與生命演化的基本規(guī)律，同時(shí)也將在農(nóng)業(yè)育種和醫(yī)學(xué)上產(chǎn)生新的應(yīng)用前景。

致謝：卜夢(mèng)迪同學(xué)和李文豪老師參與了本文的資料搜集與寫(xiě)作工作。