地西他濱逆轉人乳腺癌細胞中miR-5047基因甲基化狀態的研究

楚元奎，路玉祥，方丹丹，楊 麗，李 元，郭 樂，楊 華

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，研究顯示，2018年全球乳腺癌的年患病人數超過208萬，死亡數超過62萬[1]。2019年國家癌癥中心發布的最新統計數據顯示，2015年我國乳腺癌的新發病例約為30.4萬，位列女性惡性腫瘤的首位。尋找有效的分子診斷和治療靶點對于提高乳腺癌的早治早診率和乳腺癌患者的生存率具有重要意義。微小RNA(miRNAs)在乳腺癌的發生發展過程中扮演著重要的角色[2]。研究證實抑癌miRNAs的沉默與其啟動子區的高甲基化狀態有關[3]；地西他濱(5-雜氮-2′脫氧胞苷酸，DAC)是一種去甲基化藥物，可有效逆轉抑癌miRNAs啟動子的高甲基化狀態，促進抑癌miRNAs的表達，從而抑制腫瘤細胞的生長[4-5]。本研究擬通過qRT-PCR和甲基化特異性PCR(Methylation specific PCR，MSP)檢測明確乳腺癌細胞中miR-5047的表達水平及其啟動子的甲基化狀態，以及地西他濱處理對miR-5047啟動子甲基化狀態和miR-5047表達的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細胞株：MCF-10A、MCF-7和MDA-MB-231細胞均購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.1.2 主要試劑：DMEM培養基(Gibico公司)，胎牛血清(BI公司)，Trizol試劑、DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)，EpiTect Bisulfie kit(Qiagen公司)，HiScript II Q RT SuperMix for qPCR和 ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme 公司)，miR-5047啟動子MSP、miR-5047和U6檢測引物(上海生工生物工程有限公司)，地西他濱和二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及藥物處理： MCF-7和MDA-MB-231細胞培養于含10% 胎牛血清的DMEM培養液，MCF-10A細胞培養于人乳腺上皮細胞完全培養液(中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫)。上述細胞均置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。取處于對數生長期的MDA-MB-231細胞，以2×105個/孔的密度接種于6孔板中，培養24 h后實驗組分別加入終濃度為5 μmol/L和10 μmol/L的地西他濱；繼續培養48 h 后，以0.25%胰酶消化收集細胞，PBS洗滌后用于相關檢測。

1.2.2 q-RT-PCR檢測miR-5047的表達：Trizol法提取MCF-10A、MDA-MB-231和MCF-7以及不同濃度地西他濱處理后MDA-MB-231細胞的總RNA，以NanoDrop One超微量分光光度計(Gene公司)測定濃度。按照Vazyme公司HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR和 ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書進行反轉錄和PCR檢測。miR-5047反轉錄引物5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCTTAC-3’；miR-5047上游檢測引物5’-TTGCAGCTGCGGTTGTAA G-3’，下游檢測引物5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-3’；U6上游引物5’-CTCGCTTCGGC AGCACA-3’，下游引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。使用StepOne 熒光定量PCR儀(ABI公司)進行擴增，反應體系20 μl，反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，58 ℃ 20 s，70 ℃ 20 s，40個循環。2-ΔΔCt法計算miR-5047的相對表達量，U6作為內參。

1.2.3 甲基化特異性聚合酶鏈式反應(MSP)檢測miR-5047啟動子甲基化狀態： 使用UCSC網站(http://genome.ucsc.edu)提取人miR-5047上游啟動子區2 000 bp的基因序列，Methprimer在線軟件(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)設計甲基化和非甲基化特異性檢測引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。甲基化上游引物：5’-GTAAGGTTTAGGTATGATAATCGGA-3’，下游引物：5’-CTACCTTTTAAAAAT TACTAACACACG-3’，擴增片段長度124 bp；非甲基化上游引物5’-AAGGTTTAGGTATGATAATTGGAG-3’，下游引物：5’-ACCTTTTAAAAATTACTAACACACAT-3’，擴增片段長度120 bp。按照試劑盒說明書提取各組細胞基因組DNA，各取1 μg進行亞硫酸鹽修飾。MSP反應體系20 μl，反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃(甲基化引物)或55 ℃(非甲基化引物)15 s，72 ℃ 15 s，35個循環；72 ℃ 10 min。取各組擴增產物6 μl進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀(Bio-Rad公司)拍照分析。

2 結果

2.1 miR-5047在正常乳腺上皮和乳腺癌細胞中的表達:以人乳腺正常上皮MCF-10A細胞作為對照，qRT-PCR檢測人乳腺癌MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞中miR-5047的表達。與MCF-10A細胞相比，MDA-MB-231和MCF-7細胞中miR-5047的表達顯著下調(P<0.05),見圖1(目錄后)。

2.2 miR-5047啟動子甲基化的分析：從UCSC網站提取人miR-5047上游啟動子區2 000 bp的基因序列，Gen Script在線軟件(https://www.genscript.com)分析顯示在1 435～1 640區間存在一個CpG島。使用Methprimer在線軟件在該區域內設計甲基化和非甲基化檢測引物，MSP檢測結果顯示，與MCF-10A細胞相比，MDA-MB-231和MCF-7細胞中miR-5047啟動子呈高甲基化狀態，見圖2(目錄后)。

2.3 地西他濱對MDA-MB-231細胞中miR-5047啟動子甲基化水平的影響： 為明確去甲基化藥物地西他濱是否能夠逆轉MDA-MB-231細胞中miR-5047啟動子的高甲基化狀態，使用5 μmol/L和10 μmol/L的地西他濱分別處理MDA-MB-231細胞，48 h 后收集細胞提取DNA，重亞硫酸鹽處理后進行MSP檢測。結果顯示，5 μmol/L 和10 μmol/L地西他濱處理后，甲基化產物明顯減少，非甲基化產物明顯增多，見圖3(目錄后)。

2.4 地西他濱對MDA-MB-231細胞中miR-5047表達的影響：為進一步明確地西他濱是否能夠通過調節miR-5047啟動子區的甲基化狀態從而影響miR-5047基因的表達，使用qRT-PCR法檢測不同濃度地西他濱處理后MDA-MB-231細胞中miR-5047的表達。結果顯示，5 μmol/L 和10 μmol/L地西他濱處理后，MDA-MB-231細胞中miR-5047的表達均顯著增強，見圖4(目錄后)。

3 討論

眾多研究表明，miRNAs作為一類可調控促癌基因或抑癌基因表達的非編碼基因參與了乳腺癌的發生發展過程。miR-193a可通過下調WT1的表達抑制乳腺癌的增殖和癌細胞轉移[6]。miR-135-5p通過靶向作用于Smad3抑制TGF-β誘導的上皮間質轉化和癌細胞轉移[7]，而miR-21則可通過直接靶向作用于LZTFL1促進乳腺癌細胞的增殖和轉移[8]。miR-5047定位于人17號染色體64501214至64501313區間，研究表明miR-5047在前列腺癌[9]和宮頸癌[10]中均發揮抑癌作用，然而miR5047在乳腺癌細胞中的表達和作用目前仍不明確。課題組前期研究發現circERBB2在乳腺癌細胞中高表達，并可抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移，生物信息學分析顯示miR5047是circERBB2的一個潛在靶標miRNA，提示其在乳腺癌細胞中可能呈低表達，且發揮抑癌作用。本研究通過qRT-PCR檢測發現，與正常乳腺上皮MCF-10A細胞相比，miR-5047在乳腺癌細胞MDA-MB-231細胞和MCF-7細胞中均呈低表達，初步證明miR-5047在乳腺癌中可能發揮抑癌作用。

地西他濱是一種去甲基化藥物，可通過逆轉抑癌基因啟動子的高甲基化狀態，促進其表達，進而抑制多種腫瘤細胞的生長[11-13]。盡管早期研究表明地西他濱可以誘導乳腺癌細胞視磺酸受體β2去甲基化，細胞周期捕獲和生長抑制[14]，然而其作用機制在很大程度上仍未闡明。近年來研究顯示，地西他濱還可通過調節miRNAs啟動子的甲基化水平參與腫瘤細胞的生長調控[15-16]，目前在乳腺癌研究中還鮮有關于地西他濱調控miRNA甲基化水平的報道。本研究通過MSP檢測發現，在乳腺癌細胞中，miR-5047啟動子區的甲基化水平顯著高于正常乳腺上皮MCF-10A細胞，提示其表達下調可能與其啟動子區的高甲基化狀態有關，課題組進而使用5 μmol/L和10 μmol/L濃度的地西他濱分別處理乳腺癌MDA-MB-231細胞，MSP和qRT-PCR檢測發現，地西他濱處理后，miR-5047啟動子區的甲基化水平明顯降低，與此同時，miR-5047的表達則顯著增強。上述結果進一步證實，miR-5047在乳腺癌細胞中的低表達與其啟動子區呈高甲基化狀態有關，去甲基化藥物地西他濱可通過降低miR-5047基因啟動子區的甲基化水平促進miR-5047的表達。以上結果為進一步研究miR-5047在乳腺癌細胞中的作用及機制提供了實驗依據。