六味安神中藥對小鼠鎮靜催眠作用影響的研究*

河北中醫學院藥學院 河北省高校中藥組方制劑應用技術研發中心

王婷婷 王 芮 楊偉麗 劉艷蕊 柴天川 王 茜(石家莊 050091)

提要 目的：研究酸棗仁、延胡索、百合、地黃、半夏、夏枯草6味安神中藥對戊巴比妥鈉閾下劑量小鼠的睡眠只數，閾上劑量小鼠的睡眠潛伏期和睡眠持續時間以及對對氯苯丙氨酸(PCPA)失眠小鼠腦神經遞質含量的影響，探討其鎮靜催眠的作用及機制。方法：168只昆明小鼠，隨機分為7組：正常組、酸棗仁組(2.25 g/kg)、延胡索組(1.50 g/kg)、百合組(2.25 g/kg)、地黃組(2.25 g/kg)、半夏組(1.35 g/kg)、夏枯草組(2.25 g/kg)。連續灌胃給藥10 d，通過閾下劑量戊巴比妥鈉協同睡眠實驗，觀察各組小鼠睡眠只數；通過閾上劑量戊巴比妥鈉協同睡眠實驗，觀察各組小鼠睡眠潛伏期及睡眠持續時間。96只昆明小鼠，隨機分為8組：正常組、模型組、酸棗仁組、延胡索組、百合組、地黃組、半夏組、夏枯草組。采用腹腔注射PCPA法復制失眠小鼠模型，藥物治療14 d。運用酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測血清去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)、五-羥色胺(5-HT)的含量，同法檢測垂體促腎上腺皮質激素(ACTH)和下丘腦促腎上腺皮質激素釋放素(CRH)的含量。結果：與正常組比較，各給藥組小鼠睡眠只數增加，睡眠潛伏期縮短，睡眠持續時間延長。與正常組比較，模型組小鼠血清NE、DA、ACTH和CRH含量升高，5-HT含量降低。與模型組比較，半夏組小鼠血清NE含量升高，延胡索組5-HT含量升高，其余各給藥組小鼠血清NE、DA、ACTH和CRH含量降低，5-HT含量降低。結論：酸棗仁、延胡索、百合、地黃、半夏、夏枯草6味安神中藥具有改善小鼠睡眠的作用，酸棗仁、延胡索、百合、地黃適用于睡后易醒的患者，半夏、夏枯草可以廣泛用于失眠患者。其作用機制可能與降低腦內DA、NE、ACTH、CRH水平有關。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明小鼠，雄性，體質量(18～22)g，共168只。由河北醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(冀)2018-004。實驗動物飼養于恒溫恒濕、明暗各12 h的清潔級實驗室內，自由進食攝水。該實驗通過河北中醫學院倫理委員會倫理審查。

1.2 實驗藥物 炒酸棗仁15 g，醋延胡索10 g，百合15 g，生地黃15 g，清半夏9 g，夏枯草15 g，選用廣東一方制藥有限公司生產的中藥配方顆粒劑，生產批號分別為：9070783；9061383；9071273；8120113；9051013；9040013，將藥物加入100℃蒸餾水中，加熱攪拌使其充分溶解，濃縮至所需濃度：炒酸棗仁(0.225 g/mL)、醋延胡索(0.15 g/mL)、百合(0.225 g/mL)、生地黃(0.225 g/mL)、清半夏(0.135 g/mL)、夏枯草(0.225 g/mL)。將配置好的藥液置于4℃冰箱中貯存備用。戊巴比妥鈉(德國進口分裝，批號：020402)。對氯苯丙氨酸(PCPA)，美國Sigma公司，批號：1001542324，將其充分研磨，用弱堿性生理鹽水助溶，臨用時配成40 mg/mL的混懸液。

1.3 實驗試劑與儀器 去甲腎上腺素(NE)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(批號RE59261)、多巴胺(DA) ELISA試劑盒(批號RE59161)、五-羥色胺(5-HT)ELISA試劑盒(批號RE59121)均購于德國IBL International GmbH公司； 垂體促腎上腺皮質激素(ACTH)ELISA試劑盒(批號EKE-001-21)、下丘腦促腎上腺皮質激素釋放素(CRH) ELISA試劑盒(批號EKE-019-06)，均購于PhoenixBiotech公司。1-15K高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；MK3FC酶聯免疫檢測儀(美國Thomer Fisher公司)。

1.4 6味安神中藥對戊巴比妥鈉閾上、閾下劑量鎮靜催眠作用的影響

1.4.1 分組與給藥:168只雄性昆明小鼠，隨機分為7組：正常組、酸棗仁組、延胡索組、百合組、地黃組、半夏組、夏枯草組，每組24只。各組小鼠的給藥劑量參照2015年版《中華人民共和國藥典》中規定的成人一日最大用量，根據人和動物體表系數折算為：炒酸棗仁：2.25 g/kg、醋延胡索：1.50 g/kg、百合：2.25 g/kg、生地黃：2.25 g/kg、清半夏：1.35 g/kg、夏枯草：2.25 g/kg。正常組給予等劑量的生理鹽水灌胃，各給藥組分別給予相應的治療藥物灌胃，每次用藥體積為0.01 mL/g，1次/d，連續10 d。

1.4.2 觀察指標:第10 d灌胃給藥50 min后，每組隨機選擇12只小鼠腹腔注射3.5 mg/mL戊巴比妥鈉水溶液0.1 mL/10 g，觀察注射后30 min內每組小鼠入睡只數并計算睡眠發生率。選擇剩余12只小鼠腹腔注射4.5 mg/mL戊巴比妥鈉水溶液0.1 mL/10 g，觀察并記錄注射后30 min內每組小鼠的睡眠潛伏期及睡眠持續時間。從開始注射戊巴比妥鈉到翻正反射消失時間為入睡潛伏期，從翻正反射消失到翻正反射恢復時間為睡眠時間。實驗中以動物翻正反射消失達 1 min 為入睡指標，以 30 s內翻轉達3次為睡眠結束指標。

1.5 6味安神藥對PCPA失眠小鼠的影響

1.5.1 動物分組及模型建立:將96只雄性昆明小鼠，適應性喂養1周后，隨機分為8組：正常組、模型組、酸棗仁組(2.25 g/kg)、延胡索組(1.50 g/kg)、百合組(2.25 g/kg)、地黃組(2.25 g/kg)、半夏組(1.35 g/kg)、夏枯草組(2.25 g/kg)，每組12只。參閱文獻[10]，采用腹腔注射PCPA法復制失眠小鼠模型，模型組和給藥組小鼠按40 mg/100 g腹腔注射PCPA，1次/d，連續2 d；正常組腹腔注射等劑量的生理鹽水。以小鼠晝夜節律消失，不再表現為晝伏夜精，而是日間與夜間皆活動不斷為模型建立成功的標志。

1.5.2 標本采集 末次給藥后，各組小鼠摘眼球取血，離心15 min(4 000 r/min)，分離血清，待檢測相關神經遞質指標。隨后立即取腦組織，于冰臺上分離下丘腦、垂體，置于凍存管中液氮凍存，-80 ℃冰箱保存，待檢測腦組織勻漿神經遞質含量。

1.5.3 神經遞質的檢測 用ELISA方法檢測血清NE、DA、5-HT和垂體ACTH和下丘腦CRH的含量，嚴格按照試劑盒說明書步驟進行。

1.6 統計學方法 采用 IBM SPSS 21.0 軟件進行數據分析，進行正態性檢驗，滿足正態性，采用單因素方差分析；不滿足正態性，采用Kruskal-Wails H秩和檢驗。各組數據以均數±標準差表示，以P<0.05 表示差異有顯著性。

2 結果

2.1 睡眠只數、睡眠潛伏期、睡眠持續時間 與正常組比較，各給藥組小鼠睡眠只數增加，睡眠發生率提高，睡眠持續時間顯著延長(P<0.01)，除百合組外，其余給藥組睡眠潛伏期顯著縮短(P<0.01)，百合組雖然差異無顯著性(P﹥0.05)，但從數值上可以看出也可以縮短睡眠潛伏期。6味安神藥中，睡眠發生率最高的是地黃組，半夏組睡眠潛伏期最短、睡眠持續時間最長。詳見表1、表2。

表1 6味安神中藥閾下劑量戊巴比妥鈉 睡眠協同實驗小鼠睡眠只數

表2 6味安神中藥閾上劑量戊巴比妥鈉睡眠協同實驗小鼠睡眠潛伏期、睡眠持續時間

2.2 實驗小鼠血液中NE、DA、5-HT的含量變化 與正常組比較，模型組小鼠NE、DA含量顯著升高(P<0.01)，5-HT含量顯著下降(P<0.01)。與模型組比較，除半夏組外，其余各給藥組NE含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)；所有給藥組DA含量降低(P<0.01)；延胡索組5-HT含量升高，其余各給藥組5-HT含量降低(P<0.01)。詳見表3。

表3 各組小鼠血液中NE、DA、5-HT的含量變化

2.3 實驗小鼠腦組織中ACTH、CRH的含量變化 與正常組比較，模型組小鼠ACTH、CRH含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，各給藥組小鼠ACTH含量顯著降低(P<0.01)；各給藥組小鼠CRH含量顯著降低(P<0.01)，但地黃組降低幅度明顯小于其他給藥組。詳見表4。

表4 各組小鼠腦組織ACTH、CRH的含量變化

3 討論

戊巴比妥鈉閾上劑量、閾下劑量協同睡眠實驗是評價藥物催眠功效的經典方法[11]。本研究通過采取此種方法，觀察并記錄小鼠的睡眠發生率、睡眠潛伏期和睡眠持續時間，從而明確6味具有安神作用的中藥的鎮靜催眠作用。

睡眠是一種調節中樞神經系統的過程，其發生與中樞神經遞質如 NE、DA、5-HT等的水平有關[12]。NE、DA是中樞神經系統的興奮性神經遞質，NE是一種參與覺醒的單胺類神經遞質，其釋放量增加會引起交感神經系統活性增強，導致覺醒增加[13]。DA降低可減少覺醒次數，有助于促進睡眠[14]。5-HT是中樞神經系統的抑制性神經遞質，參與睡眠—覺醒過程，延長非快速眼動睡眠, 從而抑制覺醒, 增加深度睡眠并縮短入眠期和淺睡期，被稱為腦內的“致眠因子”，對睡眠的發生和維持起著重要作用[15-16]， NE與5-HT在睡眠調節過程中呈一定的消長關系，5-HT水平升高時，NE釋放量則相對減少，繼而產生正常睡眠[17]。

下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸功能亢進，負反饋調節能力下降，是導致失眠的一個重要原因[18]。下丘腦釋放CRH, CRH作用于垂體后使其釋放ACTH，大劑量外源性的CRH補給可使健康人群夜間清醒度提高,睡眠效率降低[19]。

酸棗仁歸心、肝二經，《名醫別錄》中記載：“治煩心不得眠，虛汗，煩渴，補中益肝氣。”可以養心安神。現代藥理學表明，酸棗仁總皂苷和JuA、JuB等單體成分是其鎮靜安神，改善睡眠的主要成分[20]。實驗結果顯示，酸棗仁組DA、NE、5-HT含量較模型組相比，低于模型組，PCPA為5-HT合成抑制劑，足量給予時可維持失眠狀態長達2周之久[10]，而5-HT 可以縮短入眠期和淺睡期，所以酸棗仁對于5-HT水平降低的失眠療效不好；NE、DA降低可以減少覺醒次數，提高睡眠質量，因此酸棗仁用于鎮靜安神更適用于睡后易醒的失眠患者而不適用于不易入睡的患者。

延胡索歸肝、脾二經，具有活血、行氣、止痛的功效，能行血中氣滯，氣中血滯。有研究表明延胡索主要藥效成分生物堿，具有鎮靜、催眠、鎮痛等藥理作用[21]。實驗結果顯示，延胡索可以顯著降低DA、NE水平，減少覺醒次數；顯著升高5-HT水平，延長非快速眼動睡眠, 從而抑制覺醒。延胡索能降低ACTH和CRH水平，但相比其他組而言，降低效果不顯著，故延胡索在降低夜間清醒度的方面作用不顯著。因此，延胡索用于鎮靜安神更適用于睡后易醒的失眠患者，而不適用于早醒的患者。

百合入心、肺經，性微寒，有清心除煩、寧心安神之功[22]，其作用機制可能與增加單胺類神經遞質釋放、抑制下丘腦-垂體-腎上腺軸亢進有關[23]。實驗結果顯示，百合組調節神經遞質的水平均較好，尤其在降低NE水平方面效果最好，因此百合可以廣泛用于各種失眠患者，尤其是睡后易醒的患者。

實驗選用生地黃，性寒，味甘、苦，有清熱涼血、養陰生津之功。實驗結果顯示，地黃組調節神經遞質的水平均較好，因此地黃可以廣泛用于各種失眠患者。基于《金匱要略》中的百合地黃湯，臨床中百合地黃常配伍使用，養心肺之陰, 清心肺虛火。因此，百合、地黃用于鎮靜安神更適用于陰虛火旺，睡后易醒的失眠患者。

半夏性溫，味辛，能燥濕化痰，《醫學衷中參西錄》中記載:“半夏：味辛，性溫，有毒。凡味辛之至者，皆稟秋金收降之性，故力能下達為降胃安沖之主藥。為其能降胃安沖，所以能止嘔吐，能引肺中、胃中濕痰下行，納氣定喘。能治胃氣厥逆、吐血、衄血。”[24]夏枯草性寒、味辛、苦，有清火明目、散結消腫之功。《冷廬醫話》曰：“蓋半夏得陰而生，夏枯草得陽而長，是陰陽配合之妙也。”失眠正是一種陽不入陰之陰陽失調的疾病[25]。有研究表明，半夏與夏枯草配伍對治療失眠療效良好[26]。實驗結果顯示，半夏組和夏枯草組在調節神經遞質水平方面相對于其他組效果最顯著，因此二者無論單味藥使用還是配伍使用都可以廣泛用于失眠患者，無論是早醒、睡后易醒還是不易入睡的患者皆可使用。

綜上所述，酸棗仁、延胡索、百合、地黃、半夏、夏枯草6味安神中藥均對改善小鼠睡眠作用有一定效果，均可縮短睡眠潛伏期、延長睡眠持續時間。對治療失眠有一定的療效，酸棗仁、延胡索、百合、地黃適用于睡后易醒的患者，半夏、夏枯草可以廣泛用于失眠患者。其作用機制可能與降低腦內DA、NE、ACTH、CRH水平有關。