茵梔黃湯HPLC指紋圖譜及單煎與共煎化學成分研究*

河北中醫學院 河北省中藥配方顆粒技術創新中心 河北省中藥材品質評價與標準化工程研究中心

麻景梅 李葆林 王迎春 甄亞欽 任艷青 牛麗穎 (石家莊 050091)

提要 目的：建立中藥茵梔黃湯的HPLC指紋圖譜，并對單煎與共煎化學成分進行對比分析，闡明單煎與共煎的差別。方法：色譜柱Agilent Eclipse plus-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃，通過采集12批茵梔黃湯HPLC 指紋圖譜，建立指紋圖譜共有模式；對3批單煎混合液與共煎液指紋圖譜的相似度、峰面積進行分析，闡明兩者化學成分是否存在差異。結果：建立茵梔黃湯HPLC對照圖譜，標定27個共有峰，指認12個色譜峰，分別為4-新綠原酸、6-綠原酸、8-隱綠原酸、10-梔子苷、13-蘆丁、15-異綠原酸B、16-異綠原酸A、18-異綠原酸C、20-黃芩苷、25-千層紙素A苷、26-漢黃芩苷、27-黃芩素；3批單煎與共煎指紋圖譜相似度在0.960以上。結論：建立茵梔黃湯指紋圖譜，為其質控提供有效的方法；單煎與共煎化學成分組成一致，但峰面積有一定的差別。

茵梔黃湯由經方茵陳蒿湯(《傷寒論》)演變而成，由茵陳、梔子、黃芩、金銀花組成，具有清熱解毒，利濕退黃的功效，用于治療濕熱毒邪內蘊所致的黃疸、急慢性肝炎[1-2]。茵梔黃湯主要含黃酮類、環烯醚萜類、有機酸類等化學成分[3]，目前相關研究主要集中在茵梔黃口服液等中成藥[4-7]，而對傳統湯劑化學成分報道較少。

本實驗利用高效液相色譜技術，對茵梔黃傳統湯劑進行研究，建立茵梔黃湯指紋圖譜分析方法及對照圖譜，并對單煎與共煎HPLC 指紋圖譜進行對比分析，考察單煎與共煎化學成分的差異。在茵梔黃質量控制基礎上，闡述單煎、共煎對其化學成分的影響，為該經方的臨床使用提供科學依據。

1 實驗材料

1.1 儀器 Waters e2695高效液相色譜儀；真空冷凍干燥機(Pilot5-8L北京博醫康實驗儀器有限公司)；十萬分之一分析天平、萬分之一分析天平FA2204B(上海精科儀器有限公司)；RE-3000型旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-250型超聲波清洗器(功率250W，頻率40kHz，昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 黃芩苷(批號110715-201318，純度≥93.3%)，漢黃芩苷(批號112002-201702，純度≥98.5%)，綠原酸(批號110753-201415，純度≥96.2%)，購于中國食品藥品檢定研究院；梔子苷(批號MUST-16020401，純度≥99.03%)，新綠原酸(MUST-12113001，純度≥98%)，隱綠原酸(MUST-13013002，純度≥98%)，異綠原酸A(MUST-18040105，純度≥99.29%)，異綠原酸B(MUST-18031602，純度≥99.05%)，異綠原酸C(MUST-18031603，純度≥99.84%)，黃芩素(MUST-16031618，純度≥99.58%)，蘆丁(批號MUST-16031813，純度≥98.16%)購自成都曼斯特生物科技有限公司；千層紙素A苷(PS-011092，純度≥98.0%)購于成都普思生物科技有限公司。茵梔黃湯各樣品(自制)，乙腈、甲醇為色譜級、超純水自制。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 混合對照品溶液：分別取對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解，配成新綠原酸 0.010 mg/mL、綠原酸0.15 mg/mL、隱綠原酸0.024 mg/mL、梔子苷0.27 mg/mL、蘆丁0.078 mg/mL、異綠原酸A 0.060 mg/mL、異綠原酸B 0.012 mg/mL、異綠原酸C 0.072 mg/mL、黃芩苷0.31 mg/mL、千層紙素A苷0.050 mg/mL、漢黃芩苷0.72 mg/mL、黃芩素0.056 mg/mL的對照品混合溶液。

2.1.2 茵梔黃湯制備：按茵陳18 g，梔子12 g，黃芩、金銀花各8 g稱取，用傳統方法煎煮2次，一煎加水量為藥材量12倍，浸泡30 min，微沸煮30 min，二煎加水量為10倍，微沸煮20 min，過200目篩，合并濾液，減壓濃縮至料液比為1∶2，冷凍干燥得干膏粉。

2.1.3 供試品溶液的制備：取干膏粉約0.2 g，精密稱定，加70% 甲醇25 mL，超聲10 min，取出，放冷，補重，濾過即得供試品溶液。

2.1.4 茵梔黃湯單煎樣品溶液制備：稱取茵陳18 g，梔子12 g，黃芩、金銀花各8 g，按照“2.1.2”項下工藝參數分別進行煎煮，過濾后合并各單味飲片提取濾液，按照“2.1.3”項下制備茵梔黃湯單煎樣品溶液。

2.1.5 單味藥材樣品溶液制備：分別稱取茵陳18 g，梔子12 g，黃芩、金銀花各8 g，按照“2.1.2”項下工藝參數分別制備各單味藥材樣品，按照“2.1.3”項下制備茵梔黃湯各單味藥材樣品溶液。

2.1.6 缺味樣品溶液制備：分別按處方比按照“2.1.2”項下方法分別制備缺茵陳、缺梔子、缺金銀花、缺黃芩的缺味樣品，按照“2.1.3”項下制備茵梔黃湯缺味樣品溶液。

2.2 經方茵梔黃湯HPLC指紋圖譜的建立

2.2.1 色譜條件：色譜柱Agilent Eclipse plus-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，A相乙腈，B相0.1%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～10 min，7%→10%A；10～15 min，10%A；15～40 min，10%→20%A；40～65 min，20%→23%A；65～90 min，23%→40% A；檢測波長為238 nm；進樣量為10 μL；流量1.0 mL/min；柱溫 30 ℃。

2.2.2 精密度：取同一供試品，按“2.2.1”下色譜條件，連續6次進樣，以10號色譜峰梔子苷為S參照，各共有峰相對保留時間RSD 為0.05%～0.93%，相對峰面積 RSD為0.12%～2.78%，RSD小于3%，精密度良好。

2.2.3 穩定性：取同一供試品，按“2.2.1”項下色譜條件，分別測定 0、2、4、8、16、24 h穩定性 ，以10號色譜峰梔子苷為S參照峰，各共有峰相對保留時間RSD 0.07%～1.27%，相對峰面積RSD 0.31%～2.74%，RSD小于3%，供試品在24 h內穩定 。

2.2.4 重復性：取同一批樣品6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，以10號梔子苷為S參照峰，各共有峰相對保留時間 RSD 為0.08%～0.21%，相對峰面積 RSD 為0.16%～2.93%，RSD 小于3% ，重復性良好。

2.2.5 茵梔黃湯指紋圖譜的建立及相似度評價：制備12批次茵梔黃湯樣品(S1～S12)供試品溶液，按“2.2.1”項下條件測定，對12批 茵梔黃湯的HPLC 圖譜進行分析，生成對照圖譜，選擇27個色譜峰作為茵梔黃湯對照圖譜共有峰，其中梔子苷(10號峰)作S參照峰，計算12批次樣品相似度，結果詳見表1。相似度在0.933以上，由整體性色譜峰可知，12批茵梔黃湯樣品未受不同產地藥材影響，化學成分組成相對穩定[8-11]。

表1 12批茵梔黃湯指紋圖譜相似度

2.2.6 色譜峰指認與歸屬：根據混合對照品與茵梔黃湯對照色譜圖比對，12個色譜峰得到確定，4-新綠原酸、6-綠原酸、8-隱綠原酸、10-梔子苷、13-蘆丁、15-異綠原酸B、16-異綠原酸A、18-異綠原酸C、20-黃芩苷、25-千層紙素A苷、26-漢黃芩苷、27-黃芩素。

將單味藥材茵陳、梔子、金銀花、黃芩以及各缺味樣品按照“2.2.1”項色譜條件進行測定，將茵梔黃湯與各單味藥材、缺味樣品色譜圖進行疊加，進行各色譜峰歸屬。其中茵陳貢獻8個色譜峰，梔子貢獻8個色譜峰，黃芩貢獻8個色譜峰，金銀花貢獻12個色譜峰；其中6號色譜峰為茵陳、梔子、金銀花共有；4、8、9、15、16號色譜峰為茵陳與金銀花共有，14號色譜峰為梔子與黃芩共有；2號色譜峰為茵陳特有，1、3、5、10、19、21號色譜峰為梔子特有，7、11、12、13、17號色譜峰為金銀花特有，20、22、23、24、25、26、27號色譜峰為黃芩特有。結果詳見表2。

表2 色譜峰歸屬結果

2.3 茵梔黃湯單煎與共煎化學成分比較 取3批藥材，分別制備3批單煎與共煎樣品，按“2.2.1”項色譜條件進樣分析，對3批單煎與共煎的HPLC 圖譜進行分析，結果各指紋圖譜的相似度均在0.960以上，二者的化學成分基本一致。詳見表3。對單煎與共煎3批色譜峰面積均值大小以及相對峰面積比進行比較，共煎后未發現新的化合物，單煎和共煎化學成分相同，而峰面積不同。單煎峰面積小于共煎的有13個，為3、5、6、7、8、9、11、12、13、15、16、17、18色譜峰，主要來源于茵陳與金銀花；單煎色譜峰面積值大于共煎的有9個，1、4、14、20、21、23、25、26、27主要來源于黃芩與梔子；單煎與共煎峰面積比值無明顯差異的有5個，為2、10、19、22、24色譜峰。

表3 茵梔黃湯單煎與共煎樣品指紋圖譜相似度

采用統計學 Dunnett's T3對數據進行配對t檢驗，檢驗結果P<0.05，差異具有顯著性，有統計學意義的色譜峰只有27號峰(黃芩素)，黃芩素為黃芩特有，其單煎中峰面積值為共煎液的2倍。詳見表4。

表4 茵梔黃湯單煎混合液與共煎樣品溶液HPLC圖峰信息 (n=3)

3 討論

3.1 茵梔黃湯指紋圖譜建立 本實驗采用高效液相色譜法采集12批次樣品色譜圖，構建了茵梔黃湯的指紋圖譜，12批樣品相似度較高(大于0.933)，說明藥材的不同產地及不同批次對茵梔黃湯所含化學成分未造成差異性影響，所含化學成分較穩定。

3.2 單煎與共煎化學成分比較 采用3個不同批次藥材分別制備3份茵梔黃湯單煎混合與3份共煎樣品，單煎與共煎，相似度大于0.960，說明二者具有良好的相關性，處方藥味共煎并未產生新的化學成分。通過單煎與共煎相同量下峰面積值進行比較，發現二者峰面積具有一定的差別，但具有統計學意義的色譜峰只有27號色譜峰(黃芩素)，單煎混合液中的峰面積值為共煎液的2倍，推測茵梔黃湯共煎液中某些成分抑制了黃芩素的溶出，其他色譜峰峰面積差異均無顯著性。

本實驗建立經方茵梔黃湯的HPLC指紋圖譜，共有色譜峰涵蓋了復方的所有藥味，各藥味均具有特有峰，不僅可反映茵梔黃湯的整體化學成分信息，并對所有藥味的質量均具有控制，使其質量評價科學合理。在指紋圖譜研究基礎上，通過相似度評價，分析茵梔黃湯單煎混合液以及共煎液的差別，二者在整體化學成分組成上無差異。