聲動力聯合免疫治療抑制惡性黑色素瘤復發和轉移的機制研究

胡宏志，張艷麗，李 倩，郭雷洋，王 玲，劉亞玲*

(1.華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院骨科，湖北 武漢 430022;2.河北醫科大學第三醫院皮膚科，河北 石家莊 050051;3.河北醫科大學第三醫院骨科，河北 石家莊 050051)

惡性黑色素瘤(melanoma,MM)是一種起源于神經嵴黑色素細胞的高度侵襲性皮膚惡性腫瘤，臨床進展迅速，易早期發生廣泛轉移，預后差[1]。近年來，MM的發病率和致死率均明顯上升，給患者及其家庭帶來了沉重的經濟和精神負擔。對于晚期MM患者，目前仍然沒有有效的治療方式控制腫瘤的局部復發和遠處轉移。因此，亟待開發一種有效的治療方式激活宿主的免疫系統，產生長期免疫記憶抑制腫瘤復發和轉移。聲動力治療(sonodynamic therapy，SDT)是一種類似于光動力療法(photodynamic therapy,PDT)的治療方法，利用低強度超聲激活富集于腫瘤部位的高濃度聲敏劑產生大量活性氧(reactive oxygen specie，ROS)發揮抗腫瘤效應[2]。值得注意的是，超聲波可以穿透深部軟組織而不受黑色素的影響，所以SDT比PDT更適用于富含黑色素的MM。由于腫瘤細胞旺盛的代謝反應和腫瘤血管的非正常生長，導致腫瘤組織局部嚴重缺氧[3]，并且SDT過程的持續耗氧也會進一步加劇氧缺乏，而缺氧會極大地降低ROS的產生效率，進而影響SDT的治療效果[4]。此外，缺氧會限制免疫細胞對腫瘤的浸潤、加速腫瘤復發和轉移[5]。因此，糾正腫瘤微環境的缺氧是提高SDT治療效果的首要任務之一。線粒體是細胞內最重要的細胞器，是細胞有氧呼吸的主要來源場所。有文獻報道，線粒體相關氧化磷酸化過程中產生三磷酸腺苷后過度消耗氧氣是造成缺氧的主要原因之一[6]。因此，通過干預氧化磷酸化可以阻止三磷酸腺苷的產生，抑制腫瘤細胞對氧氣的消耗，從而解決腫瘤微環境缺氧的難題[5]。二甲雙胍(metformin,Met)是一種雙胍類口服降糖藥物，具有多種藥理作用機制，因其降糖效果顯著、不良反應小、患者依從性好而備受關注。此外，文獻報道Met對在多種癌癥中表現出具有抗腫瘤作用，包括MM[7-8]。同時，Met可以抑制線粒體氧化呼吸鏈中復合物I的活性，降低腫瘤的氧消耗[7]。因此，SDT與Met聯用一方面可以降低內源性氧消耗，改善缺氧對SDT的抵抗作用，以提高SDT的療效，另一方面可同時發揮Met的抗腫瘤效應來增強SDT的治療效果。本課題組為開發有效的策略來改善SDT的抗腫瘤免疫反應，激發宿主產生長期的免疫記憶，開展了相應的初步研究，現報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1主要試劑 氧化石墨烯(graphene oxide,GO)、葉酸氨基聚乙二醇(Folate amino polyethylene glycol,FA-PEG-NH2)、Met、Ce 6、鼠來源的MM細胞B16-F10、RPMI-1640培養基、胎牛血清、雙抗(青霉素+鏈霉素)、PBS、胰蛋白酶。

1.2方法

1.2.1材料合成 GO和FA-PEG-NH2通過縮合反應獲得GO-PEG-FA。

1.2.2細胞活力檢測 使用CCK8試劑盒進行細胞增殖檢測。將3×103個B16-F10細胞接種于96孔板中，并培養過夜。進行相應處理24 h后，將培養基替換為100 μL含有10% CCK-8溶液的培養基，避光孵育2 h后，在酶標儀450 nm讀取吸光度。

1.3統計學方法 應用GraphPad Prism version 6.01統計軟件分析數據。所有實驗至少重復三次。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

CCK8結果表明SDT聯合Met可顯著增強SDT對B16-F10的抗腫瘤效應，見表1。

表1 各組細胞中細胞增殖活力比較

3 討 論

初步研究結果表明，Met能增強SDT的抗腫瘤效應，后續實驗將完善相關實驗并驗證Met是否能有效緩解細胞內缺氧，改善缺氧對SDT的抵抗作用，實現SDT/化療聯合抗腫瘤作用，增強SDT的抗腫瘤免疫效果。值得注意的是，文獻報道由SDT引發的抗癌免疫過于短暫和脆弱，無法有效抑制腫瘤生長和復發[9]。未甲基化胞嘧啶-磷酸鳥嘌呤的寡核苷酸(cytosine-phosphate-guanine,CpG)，作為一種免疫佐劑，可與漿細胞抗原呈遞細胞(包括樹突狀細胞和巨噬細胞)中的Toll樣受體9特異性結合，刺激免疫反應產生輔助性T細胞1和促炎細胞因子[10-11]。通過聯合免疫佐劑增強SDT治療后的抗原特異性反應，進而誘導宿主對殘留腫瘤細胞產生長期的免疫記憶，是一種有前景的治療策略。

綜上所述，本課題結合前期的工作基礎和初步實驗結果設計一種能實現有效激活宿主抗腫瘤免疫的納米治療平臺，實現化療/SDT/免疫治療協同增效激活免疫系統產生長期免疫記憶，抑制MM的復發和遠處轉移。這一新的免疫治療策略通過激活宿主的抗腫瘤免疫反應獲得更好的免疫治療效果，在未來的臨床轉化中具有很大的潛力。