舒芬太尼丙泊酚靜脈復合麻醉對骨髓間充質干細胞移植治療創傷性腦損傷大鼠的影響

武 婕，陳 燕，杜曉宣*

(1.廣東省深圳市龍華區人民醫院麻醉科，廣東 深圳 518109；2.新疆烏魯木齊市新疆醫科大學第六附屬醫院麻醉科，新疆 烏魯木齊 830002)

顱腦損傷[1-2](traumatic brain injury,TBI)是發生于頭皮、顱骨和腦部的一種常見外傷，具有較高的病死率，臨床表現為意識障礙、頭昏嘔吐，重型顱腦損傷常伴隨患者代謝及生命體征紊亂、腦性水腫等癥狀，嚴重影響患者的生存質量，現階段治療常以顱內壓監護、亞低溫治療、脫水治療等非手術治療手段為主，仍缺乏特效的臨床解決方案。骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells)是一類具有多向分化潛能的干細胞[3-4]。近年來隨著干細胞移植治療研究的發展，越來越多的證據表明干細胞治療組在一定條件下能夠改善創傷性腦組織的結構與功能[5]，但對神經系統受損區域的穩定修復效果受繼發性出血、缺血性細胞壞死及自由基作用的影響仍有待提升。另一方面，前期研究表明舒芬太尼[6]及丙泊酚[7-8]分別對TBI模型大鼠神經元再生、大腦缺血缺氧損傷及神經功能的發揮具有重要作用，同時，臨床工作經驗也表明，舒芬太尼聯合丙泊酚對創傷性腦損傷具有保護作用。本研究旨在觀察舒芬太尼丙泊酚靜脈復合麻醉對骨髓間充質干細胞移植治療創傷性腦損傷大鼠行為學及病理學變化的影響，探究骨髓間充質干細胞移植、舒芬太尼丙泊酚靜脈復合麻醉治療TBI大鼠的作用機制。

1 材 料 與 方 法

1.1材料 舒芬太尼(人福醫藥)；丙泊酚(四川國瑞藥業)；水合氯醛(成都科龍化工試劑廠)；PBS、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMEM高糖培養基、胰酶等購自Hyclone；多聚甲醛、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；電子顱腦損傷儀(Custom Design&Fabrication, Inc)；電感耦合等離子發射光譜儀(上海宏達公司)；原位缺口粒端標記(TUNEL)法試劑盒、S100β ELISA試劑盒(Roche)；鬼比環肽(QIAGEN)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒均購自生工；山羊抗兔IgG、白細胞介素6(interleukin 6,IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、Bcl2-Associated X的蛋白質(Bax)、B淋巴細胞瘤2(B-cell lymphoma 2，Bcl-2)、細胞色素C(cytochrome C,Cytc)的抗體均購自Abm；TRIzol、反轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自天根生物；PCR引物委托生工生物工程有限公司設計合成，引物序列見表1。

1.2實驗動物與分組治療

1.2.1實驗動物 干細胞治療組供體動物：無特定病原體(specific pathogens free, SPF)級幼年雄性Wistar大鼠5只，2～4周齡，體重(100±10) g；干細胞治療組受體動物：SPF級成年雄性Wistar大鼠45只，體重(200±20)g，均購自新疆醫科大學實驗動物中心。大鼠于25～27 ℃恒溫，50%～70%恒濕，每12 h晝夜戒律交替條件下分籠飼養，動物實驗操作符合實驗動物保護條例，適應性喂養1周后正式開始實驗。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2骨髓間充質干細胞(干細胞治療組)的分離及培養 參照文獻報道方法，分離大鼠股骨和脛骨，暴露骨髓腔。生理鹽水沖洗并收集骨髓腔沖洗液，1 000 r/min 4 ℃低速離心10 min，用含質量分數10% FBS的DMEM高糖培養基1 mL重懸下層細胞沉淀并轉移培養至T25培養瓶中，全程無菌操作[9]。常規培養并觀察干細胞治療組細胞生長情況，穩定傳代3次后可用于后續實驗操作。

1.2.3動物分組造模及治療方法 受試大鼠隨機分為對照組、干細胞治療組及聯合治療組3組，每組15只。各組大鼠于造模干細胞治療組前12 h禁水禁食，以0.7 mL/kg比例給予大鼠腹腔注射5%水合氯醛麻醉，行俯臥位固定大鼠于立體定向支架上。剃毛暴露術區，75%乙醇消毒后沿頭正中線切開頭皮，剝離右側頂骨后以前囟為原點，用磨鉆磨開直徑約5 mm骨窗使完整硬腦膜完全暴露。使用電子顱腦損傷儀(electric cortical contusion impactor,eCCI)構建重度TBI模型大鼠，eCCI打擊參數設置參照文獻報道方法[10]。造模完成后縫合切口并再次消毒，將大鼠放回籠中飼養。首次造模3 h后，經尾靜脈給予聯合治療組1×105/mL干細胞治療組懸液0.5 mL、舒芬太尼0.5 g/kg和丙泊酚2.0 mg/kg，復合麻醉劑量選擇參照李文亮等[11]方法；干細胞治療組給予尾靜脈注射干細胞治療組懸液0.5 mL；對照組尾靜脈給予等體積生理鹽水。3組每日同一時間給予上述處理1次，共治療3周。

1.3大鼠神經功能評定 每組各抽取6只大鼠，依據改良的神經功能缺陷評分量表(modified neurological severity scales,mNSS)[12]對大鼠治療后3 d、7 d、14 d及21 d各階段神經功能進行打分評定，0～18分，分數越高代表神經系統功能損害越嚴重，重復測定3次比較均值。

1.4HE染色檢測大鼠腦組織形態學 治療結束后大鼠常規脫頸處死，斷頭分離腦組織，取視交叉位置后1 mm及6 mm處冠狀切割修整組織塊，制備海馬組織石蠟切片，經HE染色、裝片后于光學倒置顯微鏡下觀察并記錄3組腦組織形態學變化。

1.5干濕比重法測定大鼠腦組織水含量 取腦損傷區域30 mg皮層組織置于-80 ℃快速降溫凍存，提取RNA。剩余部分吸干表面水分后立即置于分析天平中稱量腦組織濕重；轉移至干燥玻璃培養皿中60 ℃烘干48 h稱量腦組織干重。參照Elliott公式計算各組大鼠腦組織水含量，取均值比較。

1.6大鼠腦組織總鈣含量與血清S100β含量測定

1.6.1大鼠腦組織總鈣含量 取部分大鼠腦組織置于4 mL混合酸(高氯酸∶硝酸=1∶4)中，超純水定容至7 mL，混勻，參照文獻采用電感耦合等離子發射光譜儀掃描測定大鼠腦組織總鈣含量[13]。

1.6.2大鼠血清S100β含量測定 取治療結束后活體大鼠頸靜脈血1～2 mL，室溫靜置30 min后4 000 r/min低速離心10 min，取上層血清，參照S100β酶聯免疫吸附測定試劑盒說明書操作測定S100β含量。

1.7大鼠腦組織細胞凋亡檢測

1.7.1TUNEL法檢測各組大鼠海馬區神經細胞凋亡指數(apoptotic index,AI) 參照TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書對大鼠腦組織石蠟切片行抗體檢測，TUNEL陽性細胞熒光顯微鏡下發散紅色熒光，鬼比環肽標記細胞骨架呈綠色熒光定位細胞質，隨機取5個視野拍照并記錄細胞總數和陽性細胞數，取均值計算AI=(陽性細胞數/總細胞數)×100%。

1.7.2Western Blot檢測大鼠腦組織凋亡相關蛋白表達 取各組大鼠腦組織50 mg勻漿裂解組織蛋白30 min，裂解產物于4 ℃ 12 000 r/min低速離心15 min，收集上清。經BCA蛋白定量試劑盒定量檢測蛋白含量后各取50 g蛋白，加入等量含1 mmol/L DTT的1×SDS上樣緩沖液煮沸變性蛋白。行10%SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后將上述蛋白轉至PVDF膜，常規抗體孵育后顯色曝光以GAPDH為內參，檢測目的蛋白表達，所得結果為比值。

1.8大鼠腦組織炎癥因子表達檢測

1.8.1免疫組織化學檢測大鼠腦組織IL-6、TNF-α、IL-1β表達分布 對大鼠腦組織石蠟切片行免疫組織化學抗體檢測，DAB顯色液顯色反應5～10 min，顯微鏡下觀察并用PBS沖洗終止顯色。常規裝片后于放大200倍的光鏡下隨機取5個視野觀察并采集圖像，觀察IL-6、TNF-α、IL-1β在各組大鼠腦組織中的表達分布差異。

1.8.2qRT-PCR檢測大鼠腦組織中相關炎性因子mRNA表達 取凍存的腦組織20 mg，充分剪碎研磨參照TRIzol試劑說明書提取大鼠腦組織總RNA，逆轉錄獲得的cDNAs，參照qRT-PCR試劑盒說明書定量檢測IL-6、TNF-α、IL-1β相關mRNA表達變化。設置反應條件如下：95 ℃預變性5 min，隨后按95 ℃變性1 min、55 ℃退火2 min、72 ℃延伸1 min的程序設置40次循環。循環結束后在95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s條件下做溶解曲線。以GAPDH為內參，每個樣品均配3個副孔，同時做陰性對照組排除PCR污染及引物二聚體干擾。以采集到的熒光信號值(Ct值)，計算2-△△Ct值分析腦水腫相關炎性因子mRNA在各組大鼠腦組織中表達水平的變化。

1.9統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1干細胞治療組細胞形態學觀察 干細胞治療組新鮮提取的原代細胞貼壁后呈均勻的梭形，核居中，個別細胞呈現星形或扁平狀多邊形態，細胞以分散的單克隆聚集方式增殖，細胞液中漂浮有懸浮細胞，見圖1A。干細胞治療組純化及傳代培養1周后，非貼壁細胞逐漸減少，貼壁的細胞融合至密度為95%，見圖1B。1∶2傳代后細胞呈放射狀或旋渦狀集落生長趨勢，細胞形態隨傳代次數增加逐漸穩定均一，最終穩定生長為梭形成纖維細胞樣。

圖1 干細胞治療組鏡下觀察的細胞形態(HE ×200 )

2.23組mNSS比較 TBI造模結束后治療3 d內，3組mNSS評分差異無統計學意義(P>0.05)；治療7 d后，聯合治療組mNSS評分顯著低于對照組；治療14 d、21 d后干細胞治療組及聯合治療組評分均顯著低于對照組，聯合治療組低于干細胞治療組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

2.3HE染色觀察腦組織形態學改變 HE染色結果顯示，TBI后對照組神經元細胞胞體出現形狀改變，細胞核呈現固縮、深染，細胞間間隙異常增大；神經元細胞可見排列松散，并伴有大量壞死。干細胞治療組與聯合治療組海馬組織較對照組病理學變化顯著改善，且聯合治療組腦組織神經細胞密度顯著恢復，海馬區細胞排列整齊，細胞核完整且著色較淺，較干細胞治療組治療效果更佳。見圖2。

表2 造模后不同時間段內3組大鼠mNSS評分比較Table 2 Comparison of mNSS Score in different time periods after modeling among three groups

圖2 HE染色觀察大鼠海馬組織病理變化( ×200)

2.43組腦組織含水量、總鈣含量及血清S100β含量比較 干細胞治療組及聯合治療組腦組織水含量、總鈣含量及血清S100β含量均低于對照組，聯合治療組低于干細胞治療組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

2.53組腦組織細胞凋亡比較 干細胞治療組、聯合治療組腦組織細胞凋亡數目及Caspase-3、Bax、Cytc蛋白表達量低于對照組，聯合治療組低于干細胞治療組，干細胞治療組、聯合治療組Bcl-2蛋白表達高于對照組，聯合治療組高于干細胞治療組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4，圖3。

2.63組腦組織中相關炎性因子表達比較 3組腦組織切片IL-6、IL-1β陽性產物呈棕褐色深染，于對照組大鼠腦部海馬組織中密集表達分布，干細胞治療組及聯合治療組大鼠中可見表達減少，IL-6、IL-1β陽性反應減弱；TNF-α陽性產物呈藍紫色深染，同樣在對照組組中顯示出高表達彌散分布，于治療組中表達減少，見圖4。干細胞治療組、聯合治療組IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達水平均低于對照組，聯合治療組低于干細胞治療組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表3 3組大鼠腦組織水含量、總鈣含量和血清S100β含量比較Table 3 Comparison of brain water content, total calcium content and serum S100 β content among three groups

圖3 3組大鼠腦組織TUNEL染色及凋亡蛋白表達

表4 3組大鼠腦組織細胞凋亡指數及凋亡蛋白相對表達水平比較Table 4 Comparison of apoptosis rate and relative protein expression levels in three groups

圖4 3組大鼠腦組織炎性因子表達及分布(免疫組織化學 ×200)

表5 3組大鼠腦組織IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達比較Table 5 Relative IL-6,IL-1β,TNF-α mRNA expression levels in three groups

3 討 論

骨髓間充質干細胞移植已經成為顱腦損傷治療的研究熱點，其顱內移植途徑主要包括側腦移植、靜脈移植、腹腔移植、動脈移植以及鼻腔內移植[14]，其中靜脈移植和經腹腔移植方法以簡單、不良反應小、對宿主傷害弱受到廣泛應用。大量研究表明，移植至損傷腦組織區的干細胞治療組可通過細胞分化替代宿主細胞、分泌神經生長因子(nerve growth factor, NGF)等神經營養因子、促進CXC等趨化因子分泌促進干細胞歸巢、調控細胞因子表達及新生血管形成等途徑對TBI發揮治療作用[15]，但真正將干細胞治療組移植應用于TBI的臨床治療，干細胞治療組的具體作用機制及移植治療的安全性等問題仍有待探索。與此同時，舒芬太尼與丙泊酚作為臨床經典麻醉藥已被廣泛應用于TBI患者的臨床手術麻醉及康復治療，其中舒芬太尼是一種新型阿片受體激動劑，能夠有效抑制細胞凋亡和炎性反應過度表達對缺血后大腦損傷發揮保護作用；丙泊酚是一種γ-氨基丁酸受體激動劑，能通過調控Ca2+電壓門控通道及抗氧化活性機制對受損神經起到治療作用。本研究結果顯示，干細胞治療組移植治療與舒芬太尼、丙泊酚等藥物治療相結合對創傷性腦損傷大鼠的綜合治療效果顯著，為此，筆者對3者的聯合作用機制進行了深入探究。

治療期間由mNSS評分可知，治療14 d后，聯合治療組較干細胞治療組對大鼠神經功能缺陷恢復的治療效果顯著增強，舒芬太尼聯合丙泊酚在干細胞治療組單一治療的基礎上促進TBI大鼠腦損傷修復，同時HE染色可見創傷性大鼠腦部海馬區病理變化得到顯著改善。查閱相關文獻可知，創傷性腦損傷機制及病理組織形態學的變化與腦水腫、細胞內鈣荷載及血清S100β等顯著相關，因此通過檢測腦組織水含量可知聯合治療組大鼠腦組織水含量及總鈣含量顯著低于干細胞治療組與單一治療組，提示舒芬太尼聯合丙泊酚對降低腦水腫、抑制鈣超載的作用更強，促進創傷性腦損傷修復；同時治療組腦組織總鈣含量的減少表明創傷性損傷與組織細胞鈣超載有關，聯用舒芬太尼與丙泊酚可有效減輕腦組織總鈣含量、逆轉TBI腦損傷。另一方面，S100β作為神經組織蛋白之一在體內發揮營養膠質細胞、促進神經元生長的作用，可通過與游離的Ca2+結合形成穩定結合鈣，誘導神經細胞的凋亡，本研究結果可知，聯合治療組治療較干細胞治療組顯著抑制大鼠體內S100β含量，這提示干細胞治療組聯合舒芬太尼與丙泊酚治療TBI大鼠腦損傷可能與抑制神經細胞凋亡、促進腦部炎癥損傷修復相關。因此進一步檢測腦組織細胞凋亡及炎性因子表達變化，結果顯示聯合治療組較干細胞治療組大鼠腦部海馬組織神經細胞凋亡率顯著降低，細胞內促凋亡關鍵因子Caspase-3、Bax、Cytc蛋白表達較干細胞治療組顯著降低，且舒芬太尼聯合丙泊酚對Cytc蛋白表達抑制更為顯著，提示聯合治療組可能通過抑制線粒體凋亡途徑抑制受損神經細胞凋亡，同時促進抗凋亡蛋白Bcl-2表達，進而影響神經細胞形態穩定及神經元生長實現對TBI大鼠的治療作用，進而推測舒芬太尼聯合丙泊酚對干細胞治療組治療TBI大鼠可能受到PI3K/Akt/GSK3β信號通路級聯反應的調控。另外，丙泊酚同時參與Ca2+門控通道的調節，其與舒芬太尼聯用能阻斷神經元神經信號傳導、改善損傷區域炎癥微環境，免疫組織化學結果顯示聯合治療組大鼠治療后腦部IL-6、IL-1β、TNF-α分布較干細胞治療組顯著減少，同時qPCR結果顯示腦組織中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA表達水平與組織炎性因子分布呈正相關，為改善TBI后大鼠顱內炎癥反應、組織水腫提供可能。

綜上所述，舒芬太尼丙泊酚靜脈復合麻醉對創傷性腦損傷大鼠神經修復具有保護作用，舒芬太尼聯合丙泊酚在干細胞治療組移植治療中可緩解腦水腫、細胞鈣超載及循環S100β的積聚，促進血液循環和微環境調節，抑制神經細胞凋亡和炎性介質的表達，促進神經元的再生及修復，改善腦組織病理變化及受損神經功能缺陷，為臨床康復采用干細胞治療組移植治療腦損傷提供了新的思路和方法。