阿格列汀聯合不同胰島素強化方案對2型糖尿病患者miR-144、miR-142表達的影響

張麗娜，吳洪波，程學哲，門曉彥，閆秋艷，高 儉

(1.河北省秦皇島市海港醫院內分泌科，河北 秦皇島 066000；2.中國人民解放軍聯勤保障部隊北戴河康復療養中心綜合內科，河北 秦皇島 066100)

2型糖尿病是糖尿病中最常見的類型之一，其基本病因為β細胞功能出現缺陷，胰島素分泌不足，無法有效降低糖、血糖水平；但部分患者胰島素分泌正常，機體對胰島素不敏感，對胰島素的利用率較低，產生抵抗，亦會導致血糖升高[1]。2型糖尿病患者在早期時無明顯癥狀，不易被察覺，多在常規體檢或伴隨慢性并發癥時發現此病；“三多一少”為典型病狀，即多食、多飲、多尿，消瘦或短期內體重減少[2]。2型糖尿病患者若出現乏力、疲勞、口干等表現，則提示代謝異常，需引起重視。隨著生活方式的改變以及人口老齡化的進程，糖尿病的發病率呈逐年上升的趨勢，對患者的生活質量和經濟帶來一定壓力[3]。在魏素濱[4]研究中，認為糖尿病是一種慢性且需終身服藥的代謝性疾病，其主要病因為具有抵抗力的胰島素相對缺乏。在劉晶等[5]研究中，采用胰島素泵可模擬機體正常的胰島素分泌過程，操作簡便、安全，且療效較好。本研究主要分析阿格列汀聯合不同胰島素強化方案對2型糖尿病患者微小RNA-144(microRNA-144，miR-144)、微小RNA-142(microRNA-142，miR-142)表達的影響，報告如下。

1 資 料 與 方 法

1.1一般資料 選取2019年3月—2020年3月我院接診的2型糖尿病患者106例作為研究對象，按照隨機數字表法將其分為胰島素泵組和基礎治療組各53例。胰島素泵組男性25例，女性28例，年齡46～73歲，平均(56.53±9.65)歲，基礎治療組男性26例，女性27例，年齡44～71歲，平均(54.63±9.55)歲。兩組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

所有研究對象及家屬均知情同意且簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2納入標準和排除標準 納入標準：①符合《中國2型糖尿病防治指南(2017年版)》[6]中的診斷標準；②糖化血紅蛋白(hemoglobin，HbAlc)≥7.0%；③初始患者HbAlc≥9.0%或空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)≥11.0 mmol/L。排除標準：①1型糖尿病、妊娠期糖尿病及特殊類型糖尿病者；②對研究所用藥物過敏或有過敏史者；③合并糖尿病急性并發癥者；④癡呆、腦血管意外、心肌梗死者；⑤入院前2年有酒依賴、神經活性藥物濫用或服用鎮靜催眠藥等藥物者。

1.3方法 兩組均采用阿格列汀進行治療，給予阿格列汀25 mg/次，1次/d，胰島素泵組采用胰島素泵進行治療，門冬胰島素持續皮下注射，初始劑量0.5 U/kg，地特胰島素，初始劑量0.2 U/kg，后期根據患者血糖水平變化適當調整劑量。基礎治療組采用皮下胰島素進行治療，門冬胰島素注射液三餐前皮下注射，初始劑量0.5 U/kg，地特胰島素注射液睡前皮下注射，初始劑量0.2 U/kg。兩組基礎胰島素是總劑量的50%，其余50%均分至三餐前給藥。

1.4指標檢測

1.4.1FBG、餐后2 h血糖(2 h blood glucose,2 hBG)、HbAlc水平、治療總費用評價 采用上海玉研科學儀器有限公司的血糖測試儀檢測FBG、2 hBG水平；采用東西儀(北京)科技有限公司的Hb201+快速血紅蛋白檢測儀檢測HbAlc水平。統計兩組治療總費用，并做比較。

1.4.2炎性因子水平評價 抽取兩組清晨空腹靜脈血3 mL，以離心半徑為5 cm、以轉速3 000 r/min離心處理10 min，分離上層血清，-80 ℃保存，待用。采用酶聯免疫吸附法檢測C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)水平，實驗步驟：將血清樣本置于室溫后，取出試劑盒，標記酶標板，制作標準品，以1∶2的稀釋液稀釋樣品；在反應孔上依次加入稀釋好的待測血清及標準品100 μL/孔，放置37 ℃恒溫孵育箱中濕育2 h；用專用洗滌液將反應板清洗3次后，加入抗體工作液(1∶100倍稀釋后)100 μL/孔，置于37 ℃恒溫孵育箱中濕育45 min；繼續清洗反應板4次后，在反應孔內加入TMB溶液100 μL/孔，置于37 ℃恒溫孵育箱中濕育45 min后在反應孔內加入終止液100 μL/孔以終止反應，在450 nm處讀OD值；以OD值為縱坐標，以標準品為橫坐標，繪制標準曲線，根據血清樣本的OD值可在標準曲線上查出CRP、TNF-α、IL-6水平。

1.4.3miR-144、miR-142表達評價 采用實時熒光定量PCR法檢測miR-144、miR-142表達水平，將待測miRNAs反轉錄成cDNA，以β-actin為內參基因，反轉錄反應體系：5 μL mRQ緩沖液(2×)、1.25 μL mRQ酶、3.75 μL RNA樣本，反轉錄反應條件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，RCR管中加入90 μL純水稀釋至100 μL，采用日本Takara Bio公司的SYBR Advantage qPCR Premix Kit試劑盒和英國Applied Biosystems公司的7500定量PCR儀進行PCR反應，定量PCR反應體積為25 μL，包括2 μL cDNA、12.5 μL SYBR Advantage預混液(2×)、0.5 μL熒光染料校正液(50×)、0.5 μL mRQ3′引物、5 μL miRNAs特異性引物和9 μL純水，定量PCR反應條件：95 ℃ 10 s、95 ℃ 5 s，65 ℃ 20 s，循環40次，采用2-△△Ct方法計算miR-144、miR-142表達量，其中△Ct=Ct目的基因-Ct內參基因(miR-451a)，實驗獨立重復3次。miR-144上游引物：5′-UACAGUAUAGAUGAUGUACU-3′，下游引物：5′-TACTGTATAGATGATGTACT-3′；miR-142上游引物：5′-UGUAGUGUUUCCUAC-UUUAU-GGA-3′，下游引物：5′-TGTAGTGTTT-CCTACTTTATGGA-3′；內參β-actin引物序列：上游：5′-CTGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3′，下游：5′-GAGGATCTTCATGAGGTAGTCA-GT-3′。

1.4.4治療效果評價 將治療效果分為顯效、有效、無效三個標準，其中顯效為FBG、2 hBG、HbAlc水平下降至正常范圍，有效為FBG、2 hBG、HbAlc水平下降超過治療前20%，無效為未達到上述標準。總有效率=(顯效+有效)例數/總例數×100%。

1.4.5不良反應發生情況評價 觀察兩組腹痛、頭暈、低血糖、尿路感染、急性胰腺炎等不良反應發生情況，并作比較。

1.5統計學方法 應用SPSS 21.0統計軟件分析數據。計量資料比較分別采用兩獨立樣本t檢驗和配對t檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組FBG、2 hBG、HbAlc水平、治療總費用比較 治療前兩組FBG、2 hBG、HbAlc水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后兩組FBG、2 hBG、HbAlc水平均低于治療前，胰島素泵組FBG、2 hBG、HbAlc水平、治療總費用低于基礎治療組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2兩組炎性因子水平比較 治療前兩組炎性因子水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后兩組炎性因子水平低于治療前，胰島素泵組炎性因子水平低于基礎治療組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表1 兩組FBG、2 hBG、HbAlc水平、治療總費用比較Table 1 Comparison of FBG, 2 hBG, HbAlc levels and total treatment costs between two groups

表2 兩組炎性因子水平比較Table 2 Comparison of the levels of inflammatory factors between two groups

2.3兩組miR-144、miR-142表達比較 治療前兩組miR-144、miR-142表達比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后兩組miR-144表達低于治療前，miR-142表達高于治療前，胰島素泵組miR-144表達低于基礎治療組，miR-142表達高于基礎治療組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 兩組miR-144、miR-142表達比較Table 3 Comparison of miR-144 and miR-142 expression between two groups

2.4兩組治療效果比較 胰島素泵組治療總有效率高于基礎治療組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 兩組治療效果比較Table 4 Comparison of therapeutic effect between two groups (n=53，例數，%)

2.5兩組不良反應發生情況比較 兩組總不良反應發生率比較差異無統計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 兩組不良反應發生情況比較Table 5 Comparison of adverse reactions between two groups (n=53，例數，%)

3 討 論

2型糖尿病發病與胰島素的分泌和胰島素異常相關聯，其中高糖毒性、胰島炎癥、終末糖基化產物形成均會對胰島β細胞造成損害[7]。如何有效控制或降低患者血糖、減少胰島素抵抗、保護胰島β細胞功能、提高患者預后，仍是目前研究熱點[8]。

地特胰島素、門冬胰島素在2型糖尿病治療中運用較為廣泛，其中地特胰島素可有效發揮降糖效果，增強胰島素聚合能力，促進其與白蛋白發生可逆性結合，在使用時需控制用量，血糖波動較小；門冬胰島素起效快且作用持續時間更短，可有效預防患者夜間出現低血糖癥狀[9-10]。隨著醫療水平的進步，胰島素泵在2型糖尿病的治療中得到廣泛運用，可有效改善胰島β細胞功能，對血糖具有長期控制作用，且無需長時間使用降糖藥物，在一定程度上減輕患者經濟負擔[11]。有研究顯示，胰島素泵可促進胰島功能得到不同程度改善，其作用機制可能為通過對胰島素生理分泌模式進行模擬，快速緩解并解除高糖毒性[12]。阿格列汀是非擬肽類二肽基肽酶4抑制劑，具有高選擇性、高效的特點，對血糖具有顯著的控制作用。本研究中，阿格列汀聯合胰島素泵可有效改善2型糖尿病患者血糖及臨床相關指標，對胰島功能具有顯著的改善作用，療效較佳。

胰島素抵抗是糖尿病的主要病因之一，其中炎癥狀態會導致胰島素抵抗并參與胰島素抵抗的發生發展，CRP、TNF-α、IL-6等炎性因子具有協同作用，可直接增進胰島β細胞的破壞和損傷，增加糖尿病的風險[13]。肝細胞CRP的產生依賴于TNF-α和IL-6，其中TNF-α對CRP這類急性相反應蛋白具有刺激作用，還可直接作用于胰島β細胞，調節胰島β細胞的胰島素信號通路，促進2型糖尿病的延續；IL-6則可誘導血管內皮細胞黏附分子表達，進而激活炎癥細胞，釋放氧自由基、蛋白酶，損傷血管內皮細胞，增加血管通透性[14-15]。在劉偉等[16]研究中，他汀類藥物在治療糖尿病的過程中可有效抑制炎性因子水平，本研究與其結果一致。在周亞男等[17]研究中，TNF-α、IL-6等炎性因子水平出現非特異性升高時，會增加血管壁厚度、管腔狹窄、血管阻力等，若炎癥反應持續，還會造成神經進一步損傷。本研究中，阿格列汀聯合不同胰島素強化方案可有效降低兩組患者炎性因子水平，且采用胰島素泵治療，可有效控制炎性反應。

在梁英智等[18]研究中，應激相關miRNAs與2型糖尿病存在線性相關的關系，其中miR-144表達升高會增加2型糖尿病患病風險，miR-142表達降低會增加2型糖尿病患病風險。miR-144是一種具有多種生物活性的miRNA，可通過靶向不同基因，對細胞起調節作用；在糖尿病的發生發展中，其參與胰腺β細胞抗凋亡作用，進而參與糖尿病抵抗[19]。在劉春興等[20]研究中，miR-144表達升高會加劇2型糖尿病的患病風險，其機制可能為miR-144可通過抑制胰島素受體底物1表達，進而破壞胰島素信號通路。此外，miR-144還可調節膽固醇代謝以及血漿中高密度脂蛋白水平，在腫瘤方面，可調節腫瘤細胞的增殖、分化、遷移[21]。本研究中，經治療后miR-144表達降低、miR-142表達升高，且胰島素泵組治療效果更佳，說明胰島素泵在治療2型糖尿病中臨床意義更大。

綜上所述，阿格列汀聯合胰島素泵可有效改善2型糖尿病患者的臨床癥狀，減輕機體炎癥反應，降低不良反應發生率，提高預后效果，其機制可能為降低miR-144表達、升高miR-142表達。