白藜蘆醇聯(lián)合順鉑對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用*

閆苗苗 潘效紅 范艷玲 劉文英 魏光成 耿 楓

（濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，煙臺(tái) 264003）

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，由于其異質(zhì)性和耐藥性及血腦屏障等因素，多以手術(shù)治療為主，傳統(tǒng)化療藥物的治療效果均不理想[1-4]。一些天然化合物具有抗癌活性,但對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用效果不如化學(xué)合成藥物[5-6]。本研究應(yīng)用具有重要生物活性的天然多酚類化合物白藜蘆醇（resveratrol，Res）[7-13]與已經(jīng)在臨床應(yīng)用過的順鉑（cisplatin，DDP）聯(lián)合用藥，作用于體外培養(yǎng)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，比較單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥的效果，為臨床用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（C6）來源于本實(shí)驗(yàn)室凍存復(fù)蘇的細(xì)胞。白藜蘆醇和順鉑購自美國(guó)Sigma公司，純度＞99%，配成100 mg/mL貯存液，-20℃?zhèn)溆谩＜?xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（Cell Counting Kit，CCK8）、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒和細(xì)胞周期試劑盒均購自南京凱基公司；Bcl-2、Bax、p-Erk1/2抗體購自博士德公司；IP細(xì)胞裂解液和預(yù)染蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)等其它所有試劑均購自江蘇碧云天。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（C6）在含有10%新生牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶的70%～80%，進(jìn)行消化、傳代、種板。

細(xì)胞增殖檢測(cè)藥物濃度，白藜蘆醇為0、10 mg/mL 和15 μg/mL；順鉑為0、3.125 μg/mL和6.25 μg/mL；聯(lián)合用藥組，白藜蘆醇+順鉑為（0+0）、（10+3.125）、（15+3.125）、（10+6.25）μg/mL 和（15+6.25）μg/mL。

其余檢測(cè)選用的藥物濃度為，對(duì)照組、白藜蘆醇為10 μg/mL；順鉑為3.125 μg/mL，白藜蘆醇+順鉑為（10+3.125）μg/mL。

1.3 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè)

細(xì)胞接種于96孔板，每孔2×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的藥物，培養(yǎng)24、48、72 h后，每組分別設(shè)立對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)立5個(gè)復(fù)孔。每孔加入10 μL CCK8的新型細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)溶液，37℃下繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 h。于450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的光密度OD值，計(jì)算細(xì)胞的增殖抑制率（IR）。

IR=（1-實(shí)驗(yàn)孔A／對(duì)照孔A）×100%。

1.4 細(xì)胞形態(tài)變化

細(xì)胞接種于24孔板，每孔2×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，加藥作用24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，每孔加4%的多聚甲醛500 μL室溫固定20 min，吸出固定液，PBS洗1次，每孔加3 μL的吖啶橙染液[14]，搖晃2 min，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞變化并拍照。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

細(xì)胞接種于6孔板，每孔2×105個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后加入藥物。收集細(xì)胞；PBS 洗滌2次后（2 000 r/min離心5 min）；加 入500 μL的binding buffer，5 μL Annexin V-FITC 和5 μL propidium iodide 于細(xì)胞懸液中混勻；在1 h內(nèi)，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡的百分比。

1.6 細(xì)胞周期檢測(cè)

細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后加入藥物24 h后，收集細(xì)胞，PBS 洗滌2次后（2 000 r/min離心5 min），加入75%的乙醇4℃固定過夜，后根據(jù)DNA含量檢測(cè)試劑盒（凱基生物公司）的說明書，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.7 免疫印跡檢測(cè)

細(xì)胞刮子收集細(xì)胞，4℃，1 500 r/min，離心10 min，棄掉上清，加80 μL RIPA裂解液冰上裂解30～40 min，12 000 r/min離心5 min；取上清液，使用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度的測(cè)定，之后加入20 μL 5×上樣緩沖液，95℃煮蛋白，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加入特異性一抗，Bcl-2、Bax、p-Erk1/2 和GAPDH，4℃過夜，漂洗孵育后，加ECL 發(fā)光液，化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)照相分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果按金正均[15]提出的概率和方法計(jì)算Q值判斷兩藥的協(xié)同作用[15]。Q=E（A+B）/[EA+（1-EA）×EB]

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇和順鉑對(duì)C6細(xì)胞增殖抑制率的影響

結(jié)果顯示（表1），白藜蘆醇和順鉑單獨(dú)作用時(shí)，隨著時(shí)間和濃度的增加，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（C6）的增殖有明顯的抑制作用；兩者聯(lián)合用藥抑瘤作用明顯強(qiáng)于單獨(dú)應(yīng)用白藜蘆醇、順鉑時(shí)，按照公式推算，Q＞1.15，兩者之間呈相互協(xié)同關(guān)系。

2.2 白藜蘆醇和順鉑對(duì)C6細(xì)胞形態(tài)的影響

不同濃度的藥物作用神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞24 h后，結(jié)果顯示（圖1）, 白藜蘆醇和順鉑單獨(dú)作用時(shí)，細(xì)胞與對(duì)照組比變化不大，而兩者聯(lián)合時(shí)細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，而且細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色的數(shù)量明顯增多,細(xì)胞變小變圓，細(xì)胞膜有出芽現(xiàn)象。

表1 白藜蘆醇和順鉑對(duì)C6細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，%）

表1 白藜蘆醇和順鉑對(duì)C6細(xì)胞增殖抑制率的影響（±s，%）

組別 濃度（μg/mL）24 h 48 h 72 h抑制率 Q值抑制率 Q值抑制率 Q值對(duì)照組 0 0.00 ±5.38--0.00 ±4.58--0.00±5.26--白藜蘆醇組 10 23.27±2.84--23.05±5.57--31.55±4.57--15 30.51±3.99--31.81±5.72--41.85±5.37--順鉑組 3.125 13.53±3.05--13.56±2.26--16.53±3.07--6.25 29.97±10.10--26.46±6.26--34.19±10.00--白藜蘆醇和順鉑組 10+3.125 57.08±3.42 1.70 63.78±4.37 1.91 67.33±1.01 1.57 10+6.25 64.69±2.17 1.40 63.30±6.27 1.46 69.74±2.75 1.27 15+3.125 62.16±3.20 1.56 65.03±1.96 1.58 75.17±3.51 1.46 15+6.25 67.88±2.90 1.32 68.97±2.26 1.38 86.92±2.62 1.41

2.3 白藜蘆醇和順鉑對(duì)C6細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V 熒光染色檢測(cè)，加入藥物濃度為0、白藜蘆醇10 μg/mL、順鉑3.125 μg/mL、白藜蘆醇+順鉑（10+3.125）μg/mL時(shí)，正常細(xì)胞率分別為98%、91%、81%、67%；從上述數(shù)據(jù)及圖2 中可以看出，二者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞凋亡率高于單獨(dú)應(yīng)用，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩藥合用效果，Q＞1.15，表明兩者之間呈相協(xié)關(guān)系，并且明顯強(qiáng)于單獨(dú)用藥（P＜0.05）。

2.4 白藜蘆醇和順鉑對(duì)C6細(xì)胞周期的影響

對(duì)照組、10 μg/mL 白藜蘆醇和3.125 μg/mL 順鉑時(shí)，細(xì)胞G2期的百分比為11.3%、12.8%、7.9%，S期分別為31.2%、29.3%和31.5%。從這組數(shù)據(jù)顯示白藜蘆醇和順鉑單獨(dú)作用于細(xì)胞時(shí)，對(duì)細(xì)胞的增殖周期沒有顯著影響；兩者聯(lián)合時(shí)，細(xì)胞G2期所占的比為0.3%（P＜0.05），S期所占的比為42.9%，提示細(xì)胞阻滯在S期，細(xì)胞的有絲分裂受到抑制，從而抑制細(xì)胞的增殖。

2.5 白藜蘆醇和順鉑對(duì)C6細(xì)胞Bcl-2、Bax 和p-Erk1/2表達(dá)的影響

神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（C6）在白藜蘆醇、順鉑單獨(dú)及聯(lián)合作用24 h后，結(jié)果顯示（圖4），Bax 和Bcl-2的比值在白藜蘆醇和順鉑兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)明顯變大，而且兩者聯(lián)合應(yīng)用與單獨(dú)用藥相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。p-Erk1/2 光密度比值逐漸下降，蛋白的表達(dá)量降低。其中，藥物濃度為白藜蘆醇+順鉑（10+3.125）μg/mL時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖1 神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（C6）形態(tài)的變化，標(biāo)尺=200 μm。A：對(duì)照組；B：白藜蘆醇10 μg/mL；C：順鉑3.125 μg/mL；D：白藜蘆醇+順鉑（10+3.125）μg/mL.

圖2 白藜蘆醇和順鉑對(duì)C6細(xì)胞凋亡的影響。A：對(duì)照組；B：白藜蘆醇10 μg/mL C：順鉑3.125 μg/mL；D：白藜蘆醇+ 順鉑（10+3.125）μg/mL.

圖3 白藜蘆醇和順鉑對(duì)C6細(xì)胞周期的影響。A：對(duì)照組；B：白藜蘆醇10 μg/mL；C：順鉑3.125 μg/mL；D：白藜蘆醇+順鉑（10+3.125）μg/mL.

圖4 白藜蘆醇和順鉑對(duì)C6細(xì)胞Bcl-2、Bax 和p-Erk1/2表達(dá)的影響

3 討論

白藜蘆醇為天然植物補(bǔ)體，在多種腫瘤中可通過多種途徑在腫瘤各階段抑制腫瘤發(fā)展[16-21]。但有關(guān)白藜蘆醇在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的研究報(bào)道甚少，本研究將白藜蘆醇作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞C6后，顯示其在體外可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。順鉑是臨床常用于治療腫瘤的化療藥物，但其副作用很大。本研究將白藜蘆醇與順鉑聯(lián)合作用于神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，希望白藜蘆醇協(xié)同順鉑使其在低劑量時(shí)能夠增強(qiáng)對(duì)癌細(xì)胞的作用，由于順鉑劑量的減少，從而減輕其副作用。

本研究主要探討白藜蘆醇能否增強(qiáng)順鉑對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤C6細(xì)胞的增殖抑制作用。CCK8 檢測(cè)的細(xì)胞增殖抑制率結(jié)果表明白藜蘆醇和順鉑單用藥組可以抑制細(xì)胞增殖,并且具有時(shí)間和濃度依賴性；聯(lián)合用藥兩者存在協(xié)同作用（Q ≥1.15）。流式細(xì)胞儀檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)聯(lián)合用藥兩者存在協(xié)同作用。

吖啶橙染色，熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示細(xì)胞在聯(lián)合用藥時(shí),細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞核呈現(xiàn)黃綠色的數(shù)量明顯增多，細(xì)胞的體積變小變圓，細(xì)胞膜有出芽現(xiàn)象。

細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)2 者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，細(xì)胞G2期的比例明顯減少，S期的比例明顯增多。分析細(xì)胞可能阻滯在S期，從而抑制細(xì)胞的增殖。

經(jīng)白藜蘆醇和順鉑單獨(dú)用藥和聯(lián)合用藥處理的C6細(xì)胞，與對(duì)照組比較，Bax 和Bcl-2的比值在白藜蘆醇和順鉑兩者聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可以看出Bax蛋白或蛋白同源二聚體占優(yōu)勢(shì)，細(xì)胞凋亡被誘導(dǎo)。表明白藜蘆醇和順鉑誘導(dǎo)C6細(xì)胞凋亡是通過調(diào)控Bcl-2和Bax 基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)。經(jīng)白藜蘆醇和順鉑聯(lián)合處理的C6細(xì)胞，與對(duì)照組比較,其p-Erk1/2 基因表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因?yàn)楫?dāng)Erk1/2 被激活后，表現(xiàn)為磷酸化的活性形式p-Erk1/2，可能是抑制了Ras-Raf-MEK-Erk 信號(hào)通路途徑，細(xì)胞質(zhì)中的信號(hào)不能正常傳遞到細(xì)胞核，或是傳遞到細(xì)胞核中的信號(hào)是錯(cuò)誤的，結(jié)果影響了正常的核轉(zhuǎn)錄因子與DNA之間的相互作用，抑制細(xì)胞增殖。

總之，白藜蘆醇和順鉑能協(xié)同抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞株C6的增殖，在分子水平上即通過調(diào)控Bcl-2和Bax 基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡，又通過Ras-Raf-MEK-Erk 信號(hào)通路途徑，抑制細(xì)胞的增殖。