MiR-610通過下調(diào)雙微體基因2的表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移*

周淑敏 趙二趁 蘇 晴 宋艷芳 王志景

（1 周口市中心醫(yī)院病理科，周口 466000；2 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，新鄉(xiāng) 453003）

卵巢癌是第二常見的婦科癌癥，65%的卵巢癌確診時(shí)已為晚期，并且轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處的器官，而晚期卵巢癌的5年生存率約為30%[1-2]。微小RNA（MicroRNA，miR）通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制各種細(xì)胞過程。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，miRNA在各種人類癌癥中有異常表達(dá)，并且作為致癌基因或腫瘤抑制因子調(diào)節(jié)癌癥的發(fā)展。研究表明，miR-610在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用，如miR-610通過直接靶向酰基甘油激酶在口腔鱗癌中發(fā)揮抑癌作用[2]，通過靶向TWIST1表達(dá)抑制骨肉瘤的致瘤性[3]，通過靶向脂蛋白受體相關(guān)蛋白6抑制黑色素瘤的腫瘤生長(zhǎng)[4]。Sun等[5]研究表明 miR-610在結(jié)直腸癌中表達(dá)降低，miR-610的異位表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，并上調(diào)E-鈣黏著蛋白（E-carderin）表達(dá)和下調(diào)N-鈣黏著蛋白（N-cadherin）表達(dá)，但miR-610在卵巢癌中的作用和機(jī)制尚不清楚。卵巢癌高死亡的原因是確診時(shí)卵巢癌已經(jīng)轉(zhuǎn)移擴(kuò)散，而腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力反映了腫瘤的轉(zhuǎn)移性[6]。本研究主要探討miR-610通過調(diào)節(jié)雙微體蛋白（double minute 2，MDM2）的表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移的作用，以期為卵巢癌的分子治療提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基（北京清大天一科技有限公司，貨號(hào)：MD800）；胎牛血清（北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：QS071），青霉素和鏈霉素雙抗溶液（北京沃比森科技有限公司，貨號(hào)：C0160-611），Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（上海少辛生物科技有限公司，貨號(hào)：11668-019），miR-NC、miR-610 mimic、miR-610 inhibitor、pc-MDM2質(zhì)粒及各種引物由北京奧科有限公司設(shè)計(jì)并合成，SYBR-Green PCR試劑盒（嘉興藍(lán)諾盛生物科技有限公司，貨號(hào)：RT0411-03），雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（北京威格斯生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：T002），cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海彩佑實(shí)業(yè)有限公司，貨號(hào)：C-8020），Transwell 小室（上海玉博生物科技有限公司，貨號(hào)：3599），BCA試劑盒（西安浩特生物科技有限公司，貨號(hào)：WB027），RIPA裂解緩沖液（上海雅酶生物科技有限公司，貨號(hào)：PC101），GAPDH抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、鼠MDM2抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔單克隆二抗（上海艾博抗生物公司，貨號(hào)：ab18602、ab1416、ab18203、ab16895、ab6728）。

1.2 組織樣品

該研究根據(jù)《赫爾辛基宣言》的道德準(zhǔn)則進(jìn)行，并獲得周口市中心醫(yī)院研究倫理委員會(huì)和臨床醫(yī)學(xué)學(xué)院的批準(zhǔn)。組織樣品從本院進(jìn)行腫瘤切除術(shù)中獲取，所有志愿者均同意，并簽署了書面知情同意書。

1.3 細(xì)胞及培養(yǎng)

正常卵巢上皮細(xì)胞系HOSEpiC 和6種人宮頸癌細(xì)胞系SKOV3、ES-2、OVCAR-3、HO8910、CaOV-3 和COC1均購(gòu)自ATCC，在37℃、5%CO2條件下，于RPMI-1640培養(yǎng)基（10%胎牛血清、100 U/mL的青霉素和鏈霉素雙抗溶液）中培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR檢測(cè)miR-610與MDM2 mRNA的表達(dá)

將正常卵巢組織和卵巢癌組織剪碎，并研磨，然后裂解提取總RNA，并用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。對(duì)于細(xì)胞，將正常卵巢上皮細(xì)胞系HOSEpiC 和6種人宮頸癌細(xì)胞系SKOV3、ES-2、OVCAR-3、HO8910、CaOV-3和COC1接種在12孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到近85%融合時(shí)，用RIPA裂解提取總RNA，并用cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按SYBR-Green PCR 試劑盒說明書操作進(jìn)行RT-PCR。miR-610的循環(huán)條件為：95℃ 15 s 和61℃ 35 s的40個(gè)循環(huán)，用U6 標(biāo)準(zhǔn)化。MDM2的循環(huán)條件：94℃ 20 s 和60℃ 60 s的40個(gè)循環(huán)，用GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)化。使用2-ΔΔct方法計(jì)算。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)分析。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)期HO8910細(xì)胞，以每孔1×106密度接種于12孔板。當(dāng)達(dá)到85%融合，根據(jù)Lipofectamine 2000 說明書按照分組將miR-NC、miR-610 mimic、miR-610 inhibitor、pc-MDM2 質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進(jìn)入HO8910細(xì)胞。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)

將1.5 中轉(zhuǎn)染的HO8910細(xì)胞以每孔1×106的密度接種在12孔板中，并鋪滿單層，然后再用小號(hào)槍頭在孔中間垂直劃痕并拍攝圖像。接著，在37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后拍攝的圖像。細(xì)胞遷移能力用Image J 檢測(cè)的劃痕閉合率來表示。劃痕閉合率（%）=（0 h時(shí)的劃痕面積-24 h時(shí)的劃痕面積）/ 0 h的劃痕面積×100%。

1.7 Transwell 法檢測(cè)

用Matrigel 包被過的Transwell 小室上室，4℃晾干。將1.5 轉(zhuǎn)染的HO8910細(xì)胞重懸于無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，接種至Transwell 小室上室中。將含血清的培養(yǎng)基加入Transwell 小室下室。在37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，取出Transwell 小室下室。75%預(yù)冷的乙醇固定30 min，再用0.1%結(jié)晶紫染色10 min。在顯微鏡下觀察分析，侵襲能力用每視野的平均細(xì)胞數(shù)表示。

1.8 免疫印跡法檢測(cè)

收集1.5 轉(zhuǎn)染的HO8910細(xì)胞用RIPA裂解液提取總蛋白，然后用BCA試劑盒定量蛋白的濃度。將蛋白樣品用SDS-PAGE分離后，再用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜，室溫下于脫脂牛奶中封閉蛋白2 h。接著，加入對(duì)應(yīng)的兔來源的單克隆一抗（GAPDH 1∶1 000、E-cadherin 1∶800、N-cadherin 1∶500、MDM2 1∶1 000），于4℃封閉過夜。然后，加入對(duì)應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔單克隆二抗（1∶2 000）室溫封閉1 h，最后滴電化學(xué)反應(yīng)液曝光。以GAPDH為內(nèi)參，使用軟件ImagePro Plus 6.0分析蛋白條帶灰度，蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目標(biāo)蛋白積分吸光度值/內(nèi)參蛋白GAPDH積分吸光度值。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HO8910細(xì)胞，接種于24孔板中，并在37℃、5%CO2條件的培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。然后，將1 μg PGL3-MDM2-WT（MDM2野生型）或PGL3-MDM2-MUT（MDM2突變型）以及miR-NC 或miR-610 mimic 和PRL-CMV質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入HO8910細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，HO8910細(xì)胞裂解15 min，雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)量熒光素酶的相對(duì)活性，熒光素酶的相對(duì)活性（R/F）=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。所有數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)，符合呈正態(tài)分布，多組比較進(jìn)行單因素方差分析，兩組比較使用SNK 檢驗(yàn)，校驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α=0.05（雙側(cè)）。

2 結(jié)果

2.1 MiR-610在卵巢癌組織和細(xì)胞中均低表達(dá)

與鄰近的正常組織相比，miR-610在卵巢癌組織中明顯下調(diào)（P＜0.01）（圖1A）；與正常卵巢上皮細(xì)胞系HOSEpiC 相比，在人宮頸癌細(xì)胞系SKOV3、ES-2、OVCAR-3、HO8910、CaOV-3和COC1 中miR-610表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01）（圖1B），并選擇下調(diào)效果比較明顯的HO8910細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與對(duì)照組相比，miR-NC組miR-610表達(dá)并無變化，miR-610 mimic組miR-610表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），miR-610 inhibitor組miR-610表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），表明轉(zhuǎn)染成功，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖1C）。

圖1 RT-PCR檢測(cè)miR-610的表達(dá)水平

2.2 MiR-610抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞遷移和侵襲能力

與對(duì)照組相比，miR-NC組卵巢癌HO8910細(xì)胞劃痕閉合率、侵襲細(xì)胞數(shù)目及相關(guān)蛋白表達(dá)并無變化，miR-610 mimic組卵巢癌HO8910細(xì)胞劃痕閉合率明顯降低、侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少、E-cadherin明顯上調(diào)、N-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），miR-610 inhibitor組卵巢癌HO8910細(xì)胞劃痕閉合率明顯升高、侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯增多、E-cadherin明顯下調(diào)、N-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）（圖2）。

圖2 MiR-610 抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞遷移和侵襲能力

2.3 MiR-610 靶向下調(diào)MDM2

經(jīng)過生物信息網(wǎng)站TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)，miR-610與MDM2 存在靶向關(guān)系，且在 3'UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)。通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系（圖3A），與MDM2-WT+ miR-NC組、MDM2-MUT+ miR-NC組和MDM2-MUT+miR-610組相比較，MDM2-WT+ miR-610組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.01）（圖3B）。與鄰近的正常組織相比，MDM2 在卵巢癌組織中明顯上調(diào)（P＜0.01）（圖3C）。在卵巢癌中，MDM2表達(dá)與miR-610表達(dá)負(fù)相關(guān)（r=0.9192）（圖3D）。

與對(duì)照組相比，miR-610 mimic組MDM2表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），pc-MDM2組MDM2表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；與miR-610 mimic組相比，miR-610+pc-MDM2組MDM2表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01），表明轉(zhuǎn)染成功（圖4）。

2.4 MiR-610 通過靶向下調(diào)MDM2 抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞遷移和侵襲能力

結(jié)果顯示（圖5），與對(duì)照組相比，miR-610 mimic組卵巢癌HO8910細(xì)胞劃痕閉合率明顯降低、侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少、E-cadherin 明顯上調(diào)、N-cadherin表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），pc-MDM2組卵巢癌HO8910細(xì)胞劃痕閉合率明顯升高、侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯增多、E-cadherin 明顯下調(diào)、N-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）；與miR-610 mimic組相比，miR-610+pc-MDM2組卵巢癌HO8910細(xì)胞劃痕閉合率明顯升高、侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯增多、E-cadherin明顯下調(diào)、N-cadherin表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.01）。

圖3 MiR-610 靶向下調(diào)MDM2

圖4 各組中MDM2的表達(dá)水平

圖5 MiR-610 通過靶向下調(diào)MDM2 抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞遷移和侵襲能力

3 討論

MiRNA 是一組參與基因表達(dá)調(diào)控的非編碼RNA，對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲、凋亡和分化等多種生命活動(dòng)具有調(diào)節(jié)作用。越來越多的證據(jù)表明，miRNA 在各種類型的人類癌癥中異常表達(dá)，但其在腫瘤發(fā)生中的功能和分子機(jī)制仍不明確[7]。鑒別癌癥相關(guān)miRNAs 將有助于改善靶向性和開發(fā)新藥。卵巢癌中也存在miRNA的異常表達(dá)，如miR-142、miR-203 等[8-9]。異常表達(dá)的miRNA 在癌癥的發(fā)展中發(fā)揮抑癌或致癌作用，如miR-126-3p通過靶向PLXNB2 抑制卵巢癌的增殖和侵襲[10]，miR-27a靶向FOXO1通過激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移[11]。已有研究表明miR-610在胃癌、肝癌等多種癌癥中低表達(dá)，發(fā)揮抑癌作用[12-13]。同之前研究相一致，本研究結(jié)果顯示miR-610在卵巢癌組織和細(xì)胞中低表達(dá)，miR-610 高表達(dá)降低卵巢癌HO8910細(xì)胞劃痕閉合率、減少侵襲細(xì)胞數(shù)目、上調(diào)E-cadherin表達(dá)、下調(diào)N-cadherin表達(dá)，miR-610 低表達(dá)結(jié)果與之相反。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是早期卵巢腫瘤向侵襲性和轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤轉(zhuǎn)化的主要過程，由于上皮特征的喪失和間質(zhì)特征的獲得，促進(jìn)了卵巢癌的侵襲性[14]。E-cadherin 和N-cadherin是腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵鈣黏蛋白，其中E-cadherin 具有抑制侵襲的作用，而N-cadherin 具有促進(jìn)侵襲的作用，它們的表達(dá)可直觀地反映癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[15]。綜上，miR-610在卵巢癌中發(fā)揮抑癌作用，抑制卵巢癌HO8910細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

MiRNA與靶基因mRNA的3'UTR堿基配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)控基因表達(dá)的核苷酸長(zhǎng)度，從而導(dǎo)致靶基因mRNA 降解或翻譯抑制。為進(jìn)一步了解miR-610 對(duì)卵巢癌的遷移和侵襲能力的作用機(jī)制，本研究使用TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR-610的靶基因，顯示miR-610與MDM23'UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，與MDM2-WT+ miR-NC組相比較，MDM2-WT+miR-610組熒光素酶活性顯著降低，說明miR-610與MDM2直接靶向結(jié)合。MDM2 基因是位于12q13-14號(hào)染色體上的原癌基因，最初是在自發(fā)轉(zhuǎn)化的小鼠成纖維細(xì)胞的雙微體染色體上擴(kuò)增的基因座中發(fā)現(xiàn)的[16]。MDM2 包含多個(gè)保守的功能域，為MDM2的致癌特性提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。研究表明MDM2 在多種人類腫瘤中過表達(dá)，包括肉瘤、白血病、乳腺癌、黑色素瘤和成膠質(zhì)細(xì)胞瘤[17]，并且與癌癥轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，導(dǎo)致患者預(yù)后差和生存期短[18]。研究表明94%的卵巢癌患者中MDM2 存在過表達(dá)，并且高水平的MDM2與卵巢癌的分期和轉(zhuǎn)移相關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示MDM2 在卵巢癌組織中高表達(dá)。MDM2表達(dá)水平受多種致癌和腫瘤抑制途徑的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，如miR-379-5p 直接靶向MDM2 抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[20]。本研究表明，miR-610 通過靶向下調(diào)MDM2的表達(dá)對(duì)卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移發(fā)揮抑制作用。

綜上所述，miR-610在乳腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，通過靶向下調(diào)MDM2的表達(dá)來抑制乳腺癌癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這些結(jié)果表明miR-610 可作為乳腺癌的新型治療靶標(biāo)，但其具體的分子通路機(jī)制和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)還有待進(jìn)一步研究。