體外骨形態發生蛋白4抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移*

李海云 楊東光 洪秀麗 李金波 王 輝

（涿州市醫院普外科，涿州 072750）

遠處轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因，而骨是乳腺癌最常見的遠處轉移部位，有65%～75%的乳腺癌可發生骨轉移[1]，其嚴重影響患者的生活質量和預后生存期。因此研究乳腺癌轉移的發生機制，尋找新的治療方式在臨床治療中具有非常重要的意義。骨形態發生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）是在乳腺癌組織中表達最為廣泛的BMP家族成員之一，其可能參與乳腺癌發生發展及骨轉移進程，但具體作用機制尚不清楚。本研究以乳腺癌MCF-7細胞為模型，通過改變BMP4基因的表達變化，觀察BMP4對乳腺癌細胞生物學行為的影響，并對可能的機制進行初步探討。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

DMEM 高糖培養基、細胞培養胰蛋白酶（0.25%Tryopsin-EDTA）、PBS緩沖液、青鏈霉素溶液購自美國HyClone公司；胎牛血清（FBS）購自美國GibcoBRL公司；Ⅰ型膠原酶購自美國Gibco公司；二甲基亞砜（DMSO）、TRIzol 試劑購自美國 Invitrogen公司；CCK-8 購自日本同仁化學研究所；Transwell 小室購自美國Millipore公司；BMP4 和β-actin 引物由金唯智生物技術有限公司合成；Matrigel膠購自美國BD公司；PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR Premix Ex Taq II（TliRNaseH Plus）購自日本TaKaRa公司；MCF-7和293-T細胞購自北京協和細胞庫

1.2 細胞培養及分組

采用添加有10%FBS的DMEM 高糖培養基，37℃、飽和濕度5%CO2條件下常規培養，MCF-7細胞2～3 d 換液，4～6 d傳代；293T細胞2～3 d 傳代一次。當細胞生長融合至90%時，棄去原培養基，PBS 輕輕洗滌細胞1遍，加入0.25%Tryopsin-EDTA 消化，顯微鏡下觀察細胞回縮變圓、細胞間隙増大時，棄去胰酶，加入含有10%FBS的DMEM 高糖培養基終止消化，輕輕吹打至單細胞懸液，MCF-7按1∶6傳代，293T按1：20傳代。將MCF-7細胞慢病毒感染后分為以下幾組：（1）空白組（Blank），慢病毒不感染MCF-7細胞；（2）慢病毒空載對照組（Lv-NC組），慢病毒空載體Lv-EGFP感染MCF-7細胞；（3）過表達實驗組（Lv-BMP4組），重組慢病毒Lv-BMP4 感染MCF-7細胞；（4）干擾實驗組（Lv-shBMP4組），重組慢病毒Lv-shBMP4 感染MCF-7細胞。

1.4 慢病毒包裝、濃縮及滴度檢測

轉染前24 h，將生長狀態良好處于對數期的293T細胞用胰酶消化制成細胞懸液，接種于10 cm細胞培養皿中；待細胞密度達到70%左右，將重組慢病毒質粒和psPAX2、pMD2.G 經PEI 共轉染到293T細胞中，用無血清DMEM培養液培養4～6 h后，更換新鮮含10%FBS的DMEM培養液。48 h 收集病毒上清液，并添加新鮮培養基繼續培養，轉染72 h后繼續收集病毒上清；4℃ 3 000 r/min離心15 min，離心收取的上清用0.45 μm 濾器進行過濾，4℃ 20 000r/min 超速離心2 h，1 mL 新鮮培養液重懸病毒沉淀，置于-80℃保存。

取對數生長期293T細胞，胰酶消化制成懸液，于96孔板加入293T細胞1×104/孔，體積100 μL，培養過夜；取10 μL 慢病毒原液，用含10%FBS的DMEM 完全培養液10倍稀釋3～5個梯度，吸棄96孔板中原培養液，每孔加入100 μL 稀釋的慢病毒液，同時設立空白對照組，37℃ 5%CO2培養24 h；吸棄稀釋病毒培養液，更換新鮮培養液，37℃5%CO2培養72 h。通過倒置熒光顯微鏡計數熒光細胞數，并結合病毒稀釋倍數計算病毒滴度。

1.5 慢病毒感染MCF-7細胞

取對數生長期的MCF-7細胞，胰酶消化制成單細胞懸液，細胞計數，3×105/孔接種于6孔板，添加培養基至每孔1.5 mL，37℃培養箱中培養。待細胞長至60%～70%匯合度時，更換新鮮培養基并添加適量慢病毒感染細胞。感染第2天，吸棄含病毒的培養液，更換新鮮的完全培養液繼續培養。感染后72 h，熒光顯微鏡下觀察感染效率。并收集感染后的細胞樣本，用于Real-time PCR 和ELISA檢測。

1.6 RT-PCR檢測

感染72 h的MCF-7用PBS洗2次，然后加入適量的TRIzol，于室溫下靜置5min，加入氯仿100 μL，靜置5min，置于4℃低溫離心機中，12 000 r/min離心15min，小心吸取上清至新的EP管（不含RNA酶）中，加入和上清等體積的異丙醇，輕微振蕩，在室溫下靜置10 min后，置于4℃低溫離心機中，12 000 g離心10 min，棄上清留沉淀，并加入預先配好的75%乙醇，洗滌白色沉淀2次，動作要輕，避免將沉淀吹散，置于4℃低溫離心機中，7 500 g離心5 min，棄掉乙醇，加入適量DEPC 水以溶解管底沉淀。測定總RNA的濃度：用核酸濃度測定儀監測提取的RNA 濃度。RNA的濃度用OD260/280 比值來表示。

按照PrimeScriptTMRT Master Mix第一鏈cDNA合成試劑盒操作說明合成cDNA，以1 μL cDNA為模板，進行 PCR 反應。反應體系：SYBR Premix Ex Taq II（2×）10 μL，引物（10 μmol/L）1 μL，模板（cDNA）1 μL，最后ddH2O 補足至總體積20 μL；混勻后上機。反應條件：95℃ 10s預變性，95℃ 5s變性，60℃ 15 s退火，72℃ 15 s延伸，40個循環。引物序列：β-actin：5'-AGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3'（上游），5'-CCATACCCAGGAAGGAAGGCT-3'（下游）；BMP4：5'-GGCTACCAGGCCTTCTACTG-3（'上游）；5'-CAGGCCTTAGGGATGCTAGA-3'（下游）。以β-actin為內參計算BMP4 mRNA相對表達量。

1.7 ELISA法檢測

收集各慢病毒感染組上清，根據ELISA試劑盒說明書對細胞培養上清中BMP4的蛋白水平進行測定。使用酶標儀在450 nm 波長下進行讀數并分析，根據標準曲線，計算分泌蛋白BMP4的濃度。

1.8 CCK-8法檢測

每組設4 各平行孔。慢病毒感染72 h后，取各感染組細胞胰酶消化制成單細胞懸液，4×103/孔，每孔100 μL/鋪96孔板，設4個時間點（1、2、3、4 d），置于培養箱中培養。到相應時間點，在鋪有MCF-7細胞的96孔板中每孔加入10 μL CCK8，輕微振蕩混勻，置于培養箱中繼續培養1 h，終止培養；將其放在酶標儀上進行檢測，將波長調為450 nm，記錄各孔的吸光度（OD）值。

1.9 劃痕實驗檢測

各組慢病毒感染MCF-7細胞72 h后，胰酶消化各感染組細胞并制成單細胞懸液，5×105/孔接種于6孔板中并補足培養液到每孔1.5 mL，置于培養箱中培養。待細胞長滿后吸去孔內培養基，用10 μL 小吸頭進行孔內劃痕，用PBS 清洗劃下的細胞，洗3次，然后在6孔板中每孔加入2.5 mL 無血清無抗生素的培養液，在熒光倒置顯微鏡下對劃痕的6孔板中乳腺癌細胞拍照，沿劃痕邊緣等距離取3個視野，測量每個視野的劃痕寬度，然后取每個視野的平均值，記為0 h 劃痕寬度。之后，分別在24、48 h時取出6孔板對劃痕細胞進行拍照，并在同一觀測點計算劃痕寬度。劃痕愈合率（%）=（0 h的劃痕寬度-48 h的劃痕寬度）/0 h的劃痕寬度×100%。以此反映MCF-7細胞橫向遷移能力的變化。

1.10 Transwell 檢測

實驗分組同1.3，采用Transwell 小室進行細胞遷移實驗，將乳腺癌 MCF-7細胞經胰蛋白酶消化及離心后計數，在Transwell 小室下室加入600 μL 含10%胎牛血清的培養液作為趨化刺激物，用8 μm 孔徑的聚碳微孔膜，50 μL的Matrigel 膠（0.2 mg/mL）包被Transwell 小室上層，于上室加入400 μL 1.25×105/mL MCF-7細胞懸液。將小室置于37℃ 5%CO2培養箱24 h后，取出Transwell 小室，吸去培養液，用PBS溶液洗2次，自然干燥，用棉簽拭去未穿膜的細胞；用4%多聚甲醛在室溫下固定20 min，風干；用結晶紫染色20 min，水洗5～6次，風干。在熒光顯微鏡下隨機選5個視野，觀察每個視野穿膜細胞數，并取平均值，以評價各組乳腺癌MCF-7細胞的侵襲能力。

1.11 統計學處理

采用SPSS 22.0 統計學軟件進行數據分析。以表示，組間比較采用單因素方差分析，組內兩兩比較采用SNK 檢驗；檢驗水準α=0.05，即以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒包裝及感染MCF-7細胞效率

熒光顯微鏡觀察顯示，進行慢病毒包裝72 h后可見綠色熒光蛋白（GFP）表達，且熒光陽性率均達90%以上，顯示慢病毒成功包裝（圖1A）。將包裝好的慢病毒顆粒梯度稀釋后感染MCF-7細胞，72 h后熒光倒置顯微鏡下觀察細胞熒光情況。結果顯示，慢病毒感染復數（MOI）值為40時，熒光顯微鏡觀察視野中90%以上的細胞均可見綠色熒光蛋白，表明此時慢病毒成功感染MCF-7細胞。因此，將MOI值40 作為感染實驗用MOI（圖1B、C、D）。

2.2 MCF-7細胞BMP4 基因 mRNA的表達

Real-time PCR檢測結果顯示，重組慢病毒體外轉染效率高，Lv-BMP4組BMP4表達的數值為4.50 ng/mL，與對照組Lv-NC表達數值1.00 ng/mL和空白組Blank表達數值1.00 ng/mL相比，差異具有統計學意義（P＜0.01），而Lv-NC對照組與空白組Blank之間相比差異無統計學意義（P＞0.05）；LvshBMP4組BMP4的mRNA表達數值為0.5 ng/mL，表達水平低于Lv-NC對照組，差異有統計學意義

（P＜0.01）。

2.3 MCF-7細胞上清中BMP4 蛋白表達水平

慢病毒轉染72 h后，ELISA檢 測MCF-7細胞BMP4 蛋白水平表達的變化，結果顯示Lv-BMP4組（3.051±0.072）ng/mL 蛋白表達水平上調，與對照組Lv-NC（1.695±0.061）ng/mL相比差異具有統計學意義（P＜0.05），而Lv-NC對照組（1.695±0.061）ng/mL與空白組Blank（1.493±0.055）ng/mL之間相比差異無統計學意義（P＞0.05）；Lv-BMP4 shRNA組（0.956±0.057）ng/mL BMP4的蛋白水平低于Lv-NC組（1.695±0.061）ng/mL，差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.4 BMP4對MCF-7細胞增殖能力的影響

CCK8 法檢測結果顯示，慢病毒感染后第3天，Lv-BMP4組增殖能力明顯低于Lv-NC組，差異具有統計學意義（P＜0.05），而Lv-NC組與Blank組之間差異無統計學意義（P＞0.05），說明Lv-BMP4感染后乳腺癌MCF-7細胞的增殖活力在第3天時受到明顯抑制；Lv-shBMP4組的增殖能力明顯高于Lv-NC組，差異有統計學意義（P＜0.05）。第4天時，Lv-BMP4組的細胞增殖活力也顯著低于對照組（P＜0.05），說明增殖抑制作用依然明顯；Lv-shBMP4組的細胞增殖活力亦顯著高于對照組（P＜0.05）。說明在重組慢病毒感染過表達BMP4后能夠在第3天和第4天抑制乳腺癌MCF-7細胞的增殖活力，而將BMP4 干擾后，乳腺癌MCF-7細胞的增殖活力明顯增高。

2.5 BMP4對MCF-7細胞遷移能力的影響

劃痕愈合實驗結果顯示（圖2），24 h時Lv-BMP4 劃痕愈合率已有低于對照組Lv-NC組的趨勢，而Lv-shBMP4組的劃痕愈合率亦有高于Lv-NC組的趨勢。在48 h，Lv-BMP4組劃痕愈合能力更加顯著，而Lv-shBMP4組的劃痕愈合能力也明顯減小（表1）。

表1 劃痕愈合實驗檢測慢病毒感染MCF-7細胞劃痕愈合率（±s，%）

表1 劃痕愈合實驗檢測慢病毒感染MCF-7細胞劃痕愈合率（±s，%）

組別 0 h 24 h 48 h Blank 0.00 25.32±1.10 51.87±5.89 Lv-NC 0.00 26.41±1.08 52.63±6.89 Lv-BMP4 0.00 17.83±0.72 27.16±2.63 Lv-shBMP4 0.00 33.21±2.65 65.39±9.72

2.6 BMP4對MCF-7細胞侵襲能力的影響

利用Transwell 基質膠體外侵襲模型觀察BMP4對MCF-7細胞侵襲的作用。結果顯示，與對照組Lv-NC 相比，Lv-BMP4組中穿過Transwell基質膠半透膜到達下表面的細胞數量明顯降低，而Lv-NC與空白組Blank組沒有明顯區別；Lv-shBMP4組與對照組相比，MCF-7細胞穿過Transwell 小室的數目顯著升高，說明BMP4 可削弱MCF-7細胞的體外侵襲能力（圖3）。

圖1 慢病毒293T細胞包裝效率及感染MCF-7細胞后感染效率，倒置熒光顯微鏡，×200，標尺=20 μm。A：慢病毒包裝后293T細胞，熒光視場；B：病毒上清感染MCF-7細胞，Lv-NC組；C：病毒上清感染MCF-7細胞，Lv-BMP4組；D：病毒上清感染MCF-7細胞，Lv-BMP4 shRNA組.

圖2 劃痕愈合實驗檢測慢病毒感染MCF-7細胞0 h (A1～D1)、24 h (A2～D2)、48 h (A3～D3)后對細胞遷移能力的影響，標尺=20 μm。A：Blank組；B：Lv-NC組；C：Lv-BMP4組；D：Lv-shBMP4組.

圖3 Transwell 遷移實驗（結晶紫染色），標尺=20 μm。A：Blank組；B：Lv-NC組；C：Lv-BMP4組；D：Lv-shBMP4組.

3 討論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，多發于40～60歲絕經前后的婦女[1]。近年來，乳腺癌發病率以每年3%的速度增長，且發病年齡也逐漸趨于年輕化[2-3]。已成為中國女性發病率最高的惡性腫瘤，嚴重威脅女性的身心健康。鑒于乳腺癌的惡性生物學特性，其最終多會出現局部復發與遠處轉移。骨轉移為乳腺癌最常見的遠端轉移部位，在發生轉移的乳腺癌患者中，占50%～70%[4]。發生乳腺癌骨轉移的患者常出現頑固性骨痛、病理性骨折、高鈣血癥、功能障礙、脊髓壓迫等一系列骨相關事件（skeletal related events，SREs），嚴重影響其生活質量，甚至導致死亡[5]。雖然近年來對乳腺癌的治療有了顯著的進步，但乳腺癌轉移尤其是骨轉移仍然是乳腺癌治療的一大難題。目前骨轉移的分子機制尚未完全明確，因此，深入研究乳腺癌骨轉移的分子機制，進一步闡明其發病機制，尋找有效的治療靶點顯得尤為重要。

骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族中最大的亞家族，由Urist于1965年發現，Wozney等從骨基質中分離出來，被鑒定出具有誘導軟骨形成的能力。BMPs 作為分泌型糖蛋白，在胚胎發育和器官形成過程中發揮著重要作用，同時，還通過調節相關基因轉錄參與多種惡性腫瘤的發生發展[6]。BMP4 是BMPs家族中的成員，與多種癌癥的發生發展密切相關。BMP4 在不同類型的癌癥中所起的作用不盡相同，具有組織特異性。有文獻報道，BMP4 可促進肝癌、黑色素瘤、結直腸癌的生長、轉移和侵襲。而在促腎上腺皮質激素瘤中則表達明顯降低，起抑癌作用[7]。BMP4 在乳腺癌組織中廣泛表達，而其在乳腺癌中的作用也不同。BMP4 可通過阻止骨髓抑制細胞（MDSC）的累積來抑制乳腺癌的轉移[8]。而研究報道[9]當miR-191表達量升高時，BMP4 可通過TGF-β 信號通路促進乳腺癌的轉移。此外，研究發現[10]，BMP4 在抑制乳腺癌細胞生長的同時，在體內外還能誘導上皮間質轉化、侵襲和轉移。鑒于BMP4 在乳腺癌中作用的雙重性，對BMP4 在乳腺癌及其細胞系中進行相關研究，豐富BMP4 在乳腺癌中可能作用機制的理論依據，顯得十分必要。我們目前的實驗研究旨在探究不同表達水平的BMP4對乳腺癌細胞系生物學行為的影響，為BMP4 在乳腺癌尤其是乳腺癌骨轉移的臨床研究提供新思路。

血管內皮細胞生長因子（vascular growth factor，VEGF）作為一個強烈的促進血管發生和促進腫瘤生長的因子。在不同種類的腫瘤細胞中通過抑制腫瘤細胞分泌VEGF，均可起到抑制腫瘤生長的作用。而BMP4 介導的信號調節通路可通過減少VEGF的分泌，從而抑制腫瘤的生長。此外，研究顯示[11]，BMP4 還可通過Smad 信號通路，使MCF-7細胞的細胞周期停滯在G1期，加速癌細胞的凋亡，顯著抑制癌細胞的生長、增殖。同時，BMP4 還可通過激活Smad 通路和p38MAPK信號通路促使癌細胞走向過早性衰老。本實驗表明通過構建BMP4過表達慢病毒載體，使BMP4基因在MCF-7細胞中過表達，通過與正常MCF-7細胞增殖能力的比較，證實了BMP4對乳腺癌細胞系MCF-7細胞增殖能力的抑制作用，而將BMP4 干擾后，乳腺癌MCF-7細胞的增殖活力明顯提高。

乳腺癌骨轉移主要以溶骨性轉移為主。乳腺癌細胞的侵襲與轉移、骨微環境的特殊性以及兩者間的相互作用構成了乳腺癌骨轉移的主要因素。成骨與破骨細胞通過分泌一些細胞因子如基質金屬蛋白酶（MMP）、血管細胞黏附因子1 等，為乳腺癌細胞的侵襲轉移提供適宜的微環境，促進乳腺癌細胞的趨化、遷移和黏附，而乳腺癌細胞通過釋放VEGF 等因子與骨基質中的受體結合，從而進一步打破成骨與破骨細胞維持的動態平衡，導致骨基質的損害與丟失，促使乳腺癌骨轉移的發生。文獻報道，BMP4 可通過抑制MMP-9的活性，抑制乳腺癌細胞MCF-7 和MDA-MB-231 細胞的轉移潛能[12]。此外，BMP-4 可抑制VEGF-D 驅動轉移淋巴結引起血管重塑，從而抑制VEGF-D 可能創建的適宜乳腺癌轉移的微環境[13]。BMP4 可能通過抑制乳腺癌細胞以及成骨和破骨細胞分泌的相關細胞因子的活性，進而造成破骨和成骨的平衡紊亂，從而在乳腺癌骨轉移發生進程中發揮作用。本實驗為了進一步研究BMP4對乳腺癌的影響，通過細胞劃痕和Transwell 侵襲實驗檢測不同表達水平的BMP4對MCF-7細胞遷移和侵襲能力的影響。細胞劃痕實驗發現24 h時Lv-BMP4 劃痕愈合率已有低于對照組Lv-NC組的趨勢，而Lv-shBMP4組的劃痕愈合率亦有高于Lv-NC組的趨勢。在48 h，Lv-BMP4組劃痕愈合能力更加顯著，而Lv-shBMP4組的劃痕愈合能力也明顯減小。細胞增殖實驗發現，與對照組Lv-NC 相比，Lv-BMP4組中穿過Transwell 基質膠半透膜到達下表面的細胞數量明顯降低，而Lv-NC與空白組Blank組沒有明顯區別；Lv-shBMP4組與對照組相比，MCF-7細胞穿過Transwell 小室的數目顯著升高，說明BMP4 可削弱MCF-7細胞的體外侵襲能力。本實驗結果表明，過表達BMP4后MCF-7細胞的細胞轉移和侵襲能力減弱，將BMP4 干擾后，乳腺癌MCF-7細胞的遷徙和侵襲能力增強。

綜上所述，本實驗研究結果表明，BMP4過表達及干擾慢病毒載體構建成功，BMP4的表達水平與乳腺癌細胞系MCF-7細胞的增殖、遷移和侵襲能力呈負相關。本次實驗僅就BMP4對MCF-7細胞生物學行為的改變進行了初步探討。乳腺癌骨轉移是一個復雜的、多種因素共同調節的過程，對于BMP4在乳腺癌細胞中的具體作用機制還需進行更深入的研究，需從多個通路綜合研究BMP4的作用機制。