蛋白激酶B2慢病毒載體的構建及其沉默效果的驗證*

戴研平 高曉勤

（1 貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院病理學與病理生理學教研室，貴陽 550004；2 遵義醫(yī)藥高等專科學校基礎醫(yī)學院，遵義 563006；3 岳陽市岳陽樓區(qū)人民醫(yī)院，岳陽 414000）

蛋白激酶B（serine/threonine kinase B，AKT）屬于絲/蘇氨酸激酶，在腫瘤發(fā)生中起著重要作用。蛋白激酶B2（AKT2）是AKT家族的重要成員之一，它可以通過PI3K 途徑被激活。PI3K/AKT途徑能夠影響腫瘤的惡性度和預后[1]。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術能夠對靶基因的mRNA 進行高效、特異降解，小干擾RNA 被導入細胞后進而促使靶基因的同源mRNA 被降解，達到高效和特異阻斷目的基因的效果[2-4]。附睪功能的異常會影響精子的成熟，導致男性不育。但目前關于基因沉默大鼠附睪組織AKT2 及其與男性生殖系統(tǒng)疾病的研究報道少見。本實驗通過大鼠附睪組織AKT2 慢病毒短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）表達載體的構建和病毒的包裝，然后將通過驗證的高滴度病毒液干擾正常成年大鼠附睪組織后，免疫印跡檢測轉染后的效果，為后續(xù)研究AKT2 基因在男性生殖系統(tǒng)的具體分子機制提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 試劑

PMAGic7.1載體（上海生物工程股份有限公司）；Taq酶和dNTP TaKaRa（DR001B）；T4 DNA ligase（Fermentas）；5×Annealing Buffer for DNA Oligos（碧云天）；AgeI-HF（NEB）；EcoRI-HF NEB（R3101L）；DH5a 感受態(tài)細胞；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒；DL2，000 DNA Marker 均購買于TaKaRa公司；AKT2抗體（Gentex公司）。

引物合成、陽性克隆測序由生工生物工程（上海）股份有限公司合作完成。SPF級的健康清潔級成年雄性SD大鼠50只，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物許可證號：SCK（貴州），2018-0001。

1.2 儀器

DNA 電泳槽DYCP-31DN、穩(wěn)壓電泳儀DYY-5（北京六一儀器廠）；電熱恒溫水槽DK-8D（上海一恒科學儀器有限公司）；凝膠成像儀Tanon-2500（上海天能科技有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱GNP-9050（上海精宏實驗設備有限公司）；恒溫搖床TH2-C（太倉市實驗設備廠）；PCR 儀cycler（Applied Biosystems）；冷凍高速離心機CL17R（Thermo）。

1.3 AKT2干擾載體的構建

1.3.1 AKT2-shRNA 靶點設計 根據(jù)基因庫報道的大鼠附睪特異AKT2 基因序列和RNAi靶點序列設計原則，篩選出3個AKT2的干擾靶點，同時設計一個陰性對照，引物合成由上海生物工程有限公司合作完成，DNA 合成片段如下（表1）。

表1 AKT2干擾靶點的DNA 合成片段

1.3.2 引物退火形成帶黏性末端的雙鏈 將DNA oligo 分別用TE（pH8.0）溶解，濃度為100 μmol/L。取相應的正義鏈和反義鏈oligo溶液，按照如下配比配置退火反應體系：10×PCR Buffer 5 μL，sense strand（100 μmol/L）5 μL，antisense strand（100 μm）5 μL，ddH2O 35 μL，總體積為50 μL。在PCR 儀上按照如下程序進行退火處理：95oC 5 min；85oC 5 min；75oC 5 min；70oC 5 min；4oC保存。退火處理后得到濃度為10 μmol/L的shRNA 模板。將所得模板溶液稀釋50倍，終濃度為200 nm，用于連接反應。

1.3.3 PMAGic7.1載體的線性化 取10 μg PMAGic7.1載體，按照如下體系進行酶切處理：10×Buffer 15 μL；BpiI（BbsI）3 μL；HindⅢ 3 μL；PMAGic7.1 10 μg；加ddH2O至150 μL；總體積為150 μL。37oC酶切2 h，瓊脂糖電泳，使用SK8132-N回收，電泳檢測估算濃度，稀釋濃度至50 ng/μL。

1.3.4 PMAGic7.1-shRNA 載體的構建 將慢病毒載體PMAGic7.1的線性化片段與shRNA-AKT-2 退火片段采用T4 DNA 連接酶在Buffer 中連接，按照如下體系進行載體的連接反應：10×T4 Ligation Buffer 2 μL；PMAGic7.1 1 μL；shDNA template（100 nmol/L）1 μL；T4 DNA ligase（5 weiss U/μL）1 μL；ddH2O 15 μL；總體積為20 μL，于22℃連接過夜，連接后的產物進行轉化試驗。

1.3.5 轉化 取1支感受態(tài)細胞（每管100 μL，-80℃保存）于冰上放置4 min，待溶解后加入10μL連接液，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30 min。將管放到預加溫到42℃的恒溫水浴鍋中熱激90 s。快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻2～3 min。每管加900 μL LB培養(yǎng)液，然后將管轉移到37℃搖床上，溫育1 h 使細菌復蘇。取200μL的轉化菌液涂布于LB 瓊脂平板上（含50 μg/mL Kanamycin）（含表達載體相應的抗生素）。倒置平皿，于恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)16 h。

1.3.6 陽性克隆鑒定與測序 從每塊平板上挑取5個菌落，接種到含50 μg/mL Kanamycin的LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)16 h，從平板生長的轉化子中取1 μL進行菌落PCR 鑒定。Primer（＋）：HU6-F2 TACGATACAAGGCTGTTAGAGAG；Primer（－）：PM-R CTATTAATAACTAATGCATGGC。陽性克隆得到350 bp條帶，陰性克隆（空載體自連）得到300 bp條帶。PCR 反應體系的配制如下：Rnasefree water 13.7 μL；10×Buffer（with Mg2+）2.0μL；dNTP 各2.5 mm 1.6 μL；Primer ID（＋）（10μm）0.8 μL；Primer ID（－）（10 μm）0.8 μL；Template 1.0 μL；Taq酶0.1 μL；總體積為20 μL。PCR 反應條件如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，10℃ 10 min，30個循環(huán)。使用天根質粒小提試劑盒（康為世紀公司）的操作方法進行質粒的抽提，所得質粒用于測序。PCR陽性克隆測序由上海生物工程有限公司合作完成，然后進行陽性克隆測序結果分析。

1.3.7 慢病毒的包裝與滴度測定 首先制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒及混合包裝質粒載體，將4種質粒載體分別進行高純度無內毒素抽提，按照Invitrogen的Lipofectamine 2000的使用說明進行HEK293T細胞轉染，轉染后 8 h 更換為完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，收集慢病毒顆粒的細胞上清液，對其濃縮得到的高滴度的慢病毒濃縮液，最后在HER293T細胞中根據(jù)病毒的預期滴度，對其進行倍比稀釋，測定和標定病毒滴度。

1.4 慢病毒載體感染大鼠附睪組織

雄性SD大鼠50只用水合氯醛麻醉后，常規(guī)消毒鋪手術巾單，暴露雙側大鼠附睪處皮膚，仔細解剖暴露附睪，空白對照組不注射慢病毒，NCshRNA陰性感染和3個干擾組（PL-AKT2-shRNA-1感染組、PL-AKT2-shRNA-2 感染組、PL-AKT2-shRNA-3感染組）大鼠附睪分別被注射200 μL 含有NC-shRNA、PL-AKT2-shRNA-1、PL-AKT2-shRNA-2、PL-AKT2-shRNA-3的病毒液。每組隨機選取5只大鼠進行處理，并在無菌動物房飼養(yǎng)14 d。14 d后麻醉大鼠，無菌剝離雙側附睪組織進行后續(xù)相關實驗。

1.5 免疫印跡實驗

提取附睪組織總蛋白，蛋白質上樣量為（20 μg /樣本），濃縮膠濃度為5 %，電泳時間為2.5 h。制作SDS-PAGE 凝膠用于分離，PVDF 膜轉移條件為70 min 200 mA，將膜完全浸沒于5 %的脫脂奶粉（37℃ 2 h）。孵育一抗AKT2 抗體（1：1 000 稀釋）4℃過夜。第2天拿出膜，TBST洗膜。37℃孵育HRP 標記的山羊抗兔IgG 2 h，TBST 沖洗膜。根據(jù)ECL 化學發(fā)光試劑盒說明書進行顯影定影。采用凝膠圖像分析系統(tǒng)（NIH）進行分析。

2 結果

2.1 PL-AKT2-shRNA重組質粒的DNA測序結果

PL-AKT2-shRNA-1：ATGACTGTAAACAA AGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAA GTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAA AATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTA CCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCT TTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG GCGACCCAACACCTTTGTCATACTCGAGTAT GACAAAGGTGTTGGGTCGTTTTTTGAATTCG GATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTA TTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATC AATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATA TGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAAT GGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCC CGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCC CATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGA CGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTG CCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATG CCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACG GTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTAC ATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTA CATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGT GATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGT GGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAA GTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTT GTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCA AAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGC AAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGG TCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCG TCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACGCCACCA TGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTG

PL-AKT2-shRNA-2：GACTGTAACACAAA GATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGT AATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAA TTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACC GTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTT ATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGTC ACTTCAGAAGTGGACACAACTCGAGTTGTGT CCACTTCTGAAGTGATTTTTTGAATTCGGATC CATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATTACC GCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAATTAC GGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTT CCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGC CTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTG ACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAAC GCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGG TGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCA GTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCC CCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCG CCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGG ACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAG TCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGC AGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGAC TCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGA CGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATC AACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCC GCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGT ACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTT TAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGG ACGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCT

PL-AKT2-shRNA-3：ATTTGACTGTAACAC AAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGA AAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTT AAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCT TACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGG CTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC GGGGTTCTTCCTCAGCATCAACTCTCGAGAGT TGATGCTGAGGAAGAACCTTTTTTGAATTCGG ATCCATTAGGCGGCCGCGTGGATAACCGTATT ACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAATCAAT TACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGA GTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCC CGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCC ATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGT AACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAAT GGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTG GCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTAC GCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGC CCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTA TGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTA TTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTT TGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTT TGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCA TTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAA AATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAA CTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGC GTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT GGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTA CCGGACGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGG AGCTGTTCACCGGGGTG

將PCR陽性克隆質粒進行DNA測序，結果與預期序列一致，證明DNA重組成功，測序結果表明陽性克隆序列正確。

2.2 免疫印跡檢測AKT2蛋白表達

各組大鼠附睪組織凝膠電泳結果顯示（圖1），重組慢病毒顆粒感染高齡大鼠附睪組織后，NCshRNA陰性感染組（1.12±0.23）的AKT2蛋白表達水平與對照組（1.18±0.10）比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），PL-AKT2-sh-RNA-1，2，3感染組（0.76±0.21，0.43±0.08，0.23±0.06）AKT2的蛋白表達水平均低于正常對照組及NC-shRNA陰性感染組（P＜0.05）。

圖1 PL-AKT2-shRNA 感染大鼠附睪組織對AKT2蛋白表達的影響

3 討論

研究證明，AKT2 在信號轉導通路中起著重要作用。AKT2與許多腫瘤的惡性度密切相關[5]，目前已經(jīng)成為腫瘤領域基因治療的重要靶點之一[6]。

RNA 干擾技術已經(jīng)在基因的功能分析、信號通路的轉導以及基因治療中被廣泛應用。然而，質粒介導的RNAi 有很大的局限性，如在體內實驗方面，轉染效率太低，基因沉默效果差，維持時間短，而慢病毒載體穩(wěn)定性強，RNAi的作用效果更持久[7-10]。RNA 干擾技術作為腫瘤基因治療的新途徑，具有穩(wěn)定性和較高的特異性[11]。短發(fā)夾狀RNA為通過使用慢病毒載體或質粒表達的siRNA。其中，慢病毒為載體的RNAi表達結構經(jīng)過轉染細胞進而整合到基因組，使得靶基因被穩(wěn)定沉默[12-15]。RNAi的發(fā)現(xiàn)、發(fā)展已經(jīng)成為國內外研究的熱點，作為一種新興的基因阻斷技術，已經(jīng)被廣泛應用于基因功能、基因治療等方面[16]。

本實驗PCR陽性克隆質粒DNA測序，結果與預期序列一致，證明DNA重組成功，即成功構建了PL-AKT2-shRNA重組表達質粒。免疫印跡檢測結果顯示，與對照組比較，NC-shRNA陰性感染組的AKT2蛋白表達水平無明顯差異，AKT2-shRNA-1，2，3感染組的蛋白表達水平均低于正常對照組及NC-shRNA陰性感染組，說明本實驗設計包裝的3種慢病毒載體均能明顯抑制大鼠附睪組織中AKT2 基因的表達，其中以PL-AKT2-shRNA-3組干擾效果最明顯。

總之，本研究成功建立了3種AKT2 基因的RNA 干擾靶點的慢病毒載體，通過陽性克隆質粒測序和免疫印跡方法證實AKT2 基因的沉默效果明顯，為下一步研究AKT2 基因為靶點的RNAi 技術治療男性不育奠定了實驗基礎。