靜電場調控p53合成對成纖維細胞增殖周期的影響*

梁媛媛 涂 曄 安曉強 江 鍵△ 崔黎麗#

（1 海軍軍醫大學衛勤系數理教研室，上海 200433；2 上海市東方醫院，上海 200120；3 海軍軍醫大學藥學院無機化學教研室，上海 200433）

細胞的遷移、生長和增殖是重要的生命運動，它在哺乳動物的胚胎發育、創面修復、炎癥反應等各種生理和病理過程中起著至關重要的作用[1-5]。

細胞是一類電偶極子，在外電場作用下細胞膜表面會產生極化現象，駐極體產生的穩定外靜電場對調控細胞的生長、分化、增殖和趨電遷移具有重要影響[6-11]。研究駐極體對細胞遷移和增殖的影響具有重要的基礎研究意義和臨床應用價值。前期的大量研究結果雖然已經基本明確駐極體產生的外電場可以調控細胞的生長、增殖、遷移和凋亡等，但對駐極體調控細胞增殖和凋亡的作用機制及其調控路徑的研究較少，尤其是與細胞增殖密切相關的細胞周期及其周期調控機制的研究更是鮮見報道。p53基因介導的細胞信號轉導途徑在調節正常細胞的生命活動中其重要作用[12-14]。本文研究駐極體靜電場調控p53 合成對成纖維細胞生長和增殖的影響，為駐極體生物效應研究提供新途徑和新思路。

1 材料和方法

1.1 駐極體的制備和分組

膜厚為13 μm的聚丙烯（polypropylene，PP）商品膜（東麗株式會社，日本），經低溫等離子體放電系統（電暈充電系統）制備成不同表面電位的正極性和負極性駐極體（雙裸面，無金屬電極）。針尖電壓為：-15 kV；柵壓分別為5 000V 和-5 000V；充電時間為5 min。駐極體的等效表面電位通過振動電容靜電計（北京華晶科技有限公司）測量。將表面電位為0的PP膜設為對照組，將表面電位為5 000V 和-5 000V的駐極體分別設為5 000V 駐極體組和-5 000V 駐極體組，簡稱5 000V組和-5 000V組。

1.2 動物和主要試劑

清潔級SD雄性大鼠，體質量（180±20）g，購自海軍軍醫大學實驗動物中心。胰蛋白酶、胎牛血清、1640培養基和雙抗等購于Gibco公司；PBS緩沖液購于Servicebio公司；CCK-8 試劑盒購于東仁化學科技（上海）有限公司；RNA 提取液購于武漢賽維爾生物科技有限公司；Hoechst 33342 購于上海如吉生物科技有限發展公司；定量PCR引物由武漢擎科創新生物科技有限公司提供；水合氯醛等常用試劑均購于中國醫藥集團化學試劑有限公司。

1.3 成纖維細胞培養

將大鼠麻醉后剔除背部毛發，潔凈背部皮膚，取下皮膚組織，用含有青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）的PBS 緩沖液沖洗，洗凈后將皮膚組織剪成小塊（1～2 mm3）置于含有20%胎牛血清的1640培養基的培養皿中，待成纖維細胞從組織塊周圍爬出，待爬出的細胞有較多數量時，吸取培養液并用0.25%胰蛋白酶37℃消化細胞1～2 min，轉入另一培養瓶中培養進行細胞傳代，待細胞傳至3～8 代后進行后續實驗。

1.4 成纖維細胞增殖活性檢測

取對數生長期第3代的成纖維細胞接種于96孔培養板中（細胞密度104個/孔），將表面電位為0、-1 000、-2 000、-5 000、1 000、2 000V和5 000V駐極體分別作用于成纖維細胞24、48 h和72 h。隨后向各孔的細胞液中加入CCK-8試劑10 μL，繼續培養1～4 h后，振蕩搖勻后用全自動酶標儀（北京諾亞威儀器儀表有限公司）在450 nm波長處測定各實驗組細胞的吸光度值（OD值），吸光度值越高，表示細胞的增殖活性越強。相對增殖能力強弱用細胞增殖率表示：增殖率=（實驗組OD值-空白組OD平均值）/（對照組OD平均值-空白組OD平均值）。式中空白組為無細胞的培養組。

1.5 細胞周期檢測

取對數生長期第3 代的成纖維細胞，在培養皿（已去除培養液）中加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶消化2 min后，制成2×107/L的單細胞懸液，接種于6孔培養板內，在1640培養液中培養24 h，將0、-5 000V 和5 000V 駐極體作用成纖維細胞48 h后，收集細胞，采用流式細胞儀檢測各實驗組的細胞周期。

1.6 成纖維細胞p53 mRNA表達檢測

取對數生長的成纖維細胞，將0V、-5 000V和5 000V駐極體作用成纖維細胞48 h后，加入TRIzol 裂解液提取細胞總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA，定量檢測擴增p53的mRNA轉錄水平。p53上游引物序列為5'-GAAGCCCTCCAAGTGTCAGC-3'，下游引物序列為5'-GGCAGAACAGCTTATTGAGGGA-3'。PCR反擴增條件為95℃ 5 s、58℃ 20 s、72℃ 31 s，39個循環。采用公式2-ΔΔCT計算mRNA表達量，每個樣品取3個復管，取均值。

1.7 統計學處理

采用SPSS Statistics 19.0 軟件進行數據分析，符合正態分布的計量數據用±s表示，兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 駐極體電荷儲存穩定性

結果（圖1）顯示經常溫等離子體制備的不同表面電位正、負極性聚丙烯駐極體的等溫表面電位衰減曲線，常溫充電的正極性和負極性聚丙烯駐極體具有優異的電荷儲存穩定性。在常溫下存放24 h，-1 000、-2 000V 和-5 000V 駐極體的等效表面電位分別是初始電位的80%、76%和65%；在常溫下存放72h，-1 000、-2 000V 和-5 000V 駐極體的等效表面電位分別是初始電位的77%、73%和63%。說明不同表面電位的負極性駐極體可以提供穩定的外靜電場用于后續細胞學實驗（圖1A）。且相同表面電位正、負極性駐極體的電荷儲存具有相似的規律（圖1B）：常溫下存放72 h，5 000V 駐極體的等效表面電位為初始值的62%，與-5 000V 駐極體在常溫下存放72 h的等效表面電位（初始值的63%）基本一致，這表明相同表面電位的正、負極性駐極體能夠提供大小相同的外靜電場。

圖1 不同表面電位駐極體等效表面電位隨時間的變化規律

2.2 駐極體對成纖維細胞增殖能力的影響

與對照組相比，不同表面電位負極性駐極體作用成纖維細胞72 h，細胞的增殖能力逐漸增強，駐極體的等效表面電位越高（提供的靜電場強度越大），成纖維細胞的增殖能力越強（圖2）。-5 000V 駐極體組細胞的增殖能力較對照組提高（1.080±0.051）倍。不同表面電位正極性駐極體作用成纖維細胞72 h，細胞的增殖能力逐漸減弱，駐極體的等效表面電位越高（提供的靜電場強度越大），成纖維細胞的增殖能力越弱。5 000V 駐極體組細胞的增殖能力是對照組的（0.900±0.059）倍（圖3）。負極性駐極體促進成纖維細胞的增殖作用和正極性駐極體抑制成纖維細胞的增殖作用與駐極體（或靜電場）的作用時間呈正相關。

圖2 不同表面電位正極性和負極性駐極體作用成纖維細胞72 h 對細胞增殖能力的影響

圖3 正極性和負極性駐極體作用成纖維細胞不同時間對細胞增殖能力的影響

2.3 駐極體對成纖維細胞生長周期的影響

與對照組相比，經-5 000V駐極體作用48 h的細胞群中處于G1期的細胞數明顯下降，從77.79%±0.52%下降至72.63%±0.07%；而G2期的細胞數顯著上升，從13.07%±0.99%增加至23.85%±0.76%（圖4B），這說明負極性駐極體作用成纖維細胞，縮短了細胞在G1期所滯留的時間，使細胞快速通過S期到達G2期，負極性駐極體具有促進細胞生長的機制之一是縮短細胞的生長周期。5 000V駐極體作用成纖維細胞48 h，處于G1期細胞的比例較對照組顯著上升從77.79%±0.52%上升至81.43%±0.17%，而G2期的細胞明顯下降從13.07%±0.99%減少至11.85%±0.52%（圖4C），這說明正極性駐極體產生的外靜電場通過使細胞阻滯于G1期而抑制細胞的生長。

圖4 不同實驗組作用成纖維細胞48 h后的細胞周期圖

2.4 駐極體對成纖維細胞p53 mRNA表達的影響

5 000 V 駐極體和-5 000V 駐極體分別作用成纖維細胞48 h后，與對照組相比，經5 000V 駐極體作用48 h后成纖維細胞中p53 mRNA的表達量為1.30±0.10，是對照組的1.3倍（P＜0.05）。而經-5 000V 駐極體作用48 h后成纖維細胞中p53 mRNA的表達量卻下降至0.71±0.07，是對照組的0.7倍（P＜0.05）。提示負極性駐極體通過下調細胞內p53基因的表達水平，誘導細胞快速通過G1期，實現促進細胞增殖的作用。

3 討論

低頻電場的生物效應是一個復雜的問題。已有很多報道表明電刺激可以影響生物大分子的合成與分解，離子通道的變化，以及細胞增殖等[15-18]。轉化生長因子β（TFG-β）和p53基因是細胞周期的重要調控因子。p53基因可通過抑制有絲分裂的過程，阻止細胞進入DNA 合成期，其表達增加能夠促使細胞凋亡[19]。我們在前期系統研究駐極體對成纖維細胞TFG-β 調控規律的基礎上[20]，研究駐極體靜電場對成纖維細胞p53基因的影響。通過研究成纖維細胞在不同極性和表面電位的駐極體靜電場過作用下，細胞增殖、凋亡及凋亡基因表達的變化，闡述駐極體靜電場調控p53 合成對成纖維細胞生長和增殖的影響。

本實驗的研究結果顯示：經低溫等離子體放電系統制備的不同極性聚丙烯駐極體具有優異的電荷儲存能力，且負極性駐極體具有促進細胞生長和增殖的作用，而正極性駐極體具有抑制細胞生長和增殖的作用。此外，負（或正）極性駐極體促進（或抑制）細胞生長和增殖的作用與駐極體產生的外靜電場強度以及電場作用細胞的時間長短呈正相關。正極性駐極體通過上調細胞內p53基因的表達，導致細胞阻滯于G1期，從而抑制細胞的增殖。而負極性駐極體則通過加快細胞通過G1期限制點的時限，促進了細胞的增殖。因此進一步證明，駐極體產生的靜電場通過調節細胞內p53 mRNA的表達量來實現對細胞增殖能力的調控。我們推測這是因為：駐極體產生的靜電場作用于成纖維細胞的主要作用靶點是細胞的細胞膜，靜電場作用于成纖維細胞，導致細胞的膜電位（或膜電容）發生改變，從而導致成纖維細胞的極化，以及細胞膜上各類膜蛋白、糖蛋白、氨基酸、生長因子和細胞因子等極化和再分布，由此影響成纖維細胞的生長周期，調控細胞的分化與增殖。

綜上所述，當細胞處于外靜電場環境下，電場作為外源刺激因子將引起成纖維細胞的細胞周期發生變化，可能是通過調控細胞內p53 mRNA的表達水平從而調控細胞的分化與增殖。