MiR-146a-5p對高脂飲食/鏈脲佐菌素誘導的糖尿病腎病大鼠腎組織的保護作用*

李 莉 李 松 曹 萌 石小娟 王 雪 王順閣

（1 平頂山市第二人民醫院內分泌科，平頂山 467000；2 新鄉醫學院第一附屬醫院內分泌科，衛輝 453100）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）占終末期腎臟疾病的45%[1-2]。DN的發病機制涉及多種因素，足細胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分，幾乎所有的腎小球疾病都與足細胞損傷有關[3-4]。此外，炎癥增強可直接破壞腎結構，并與DN的進展密切相關[5]。大量證據表明，miRNAs（microRNAs）在腎臟疾病中發揮著重要作用[6]。MiRNAs的失調已被證實與DN相關的病理事件有關，提示miRNAs有望作為DN的診斷生物標記物和治療靶點的可能性[7-8]。例如，miR-29c的過度表達通過靶向3，4脯氨酸增加炎癥反應，促進DN的進展[9]。敲除miR-27a基因能夠降低鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導的糖尿病大鼠腎細胞外基質和蛋白尿的積累，并阻止高葡萄糖誘導的系膜細胞增殖[10]。研究已證實miR-146a可抑制葡萄糖誘導的糖尿病視網膜和腎中炎性細胞因子細胞外基質蛋白的上調[11-12]。本研究以高脂飲食（high-fat diet，HFD）和STZ誘導的糖尿病大鼠作為DN模型，探討miR-146a-5p在DN發生發展中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

STZ、TUNEL試劑盒購自美國Sigma公司；蘇木精伊紅（hematoxylin-eosin，H-E）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒，RIPA裂解緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司；白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司；抗β-actin、Bax、Bcl-2、caspase 3（cas3）、cleaved cas3抗體購自英國Abcam公司；抗IL-10和iNOS抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；辣根酶標記二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 實驗動物

40只健康SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體質量200 g±20 g，購自河南省實驗動物中心，許可證號為SYXK（豫）2016-0002。在實驗過程中，將大鼠置于溫度22℃～24℃和濕度40%～70%，12 h 光/暗循環條件下飼養，并自由獲得標準的食物和水。

1.3 糖尿病腎病大鼠的誘導及實驗設計

將40只SD大鼠分為2組，第1組（n=10）以正常大鼠飲食喂養，作為正常對照組，第2組（n=30）以HFD 喂養。飲食包括1%膽固醇、10%豬油，20%蔗糖、9%蛋黃粉和60%基本飲食，大鼠可以自由飲水。HFD 喂食6周后，通過腹腔內注射溶于0.1 mol/L 檸檬酸鹽緩沖液（pH 4.5）中的新鮮制備的STZ（35 mg/kg）誘發糖尿病，對照組大鼠腹腔注射等量的檸檬酸緩沖液。誘發糖尿病3 d后，從尾靜脈收集大鼠血液以測量空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）。FBG水平≥16.7 mmol/L的動物被認為是糖尿病腎病大鼠，并被選擇進行下一步實驗。將第2組大鼠隨機分為3組（n=10）：模型組（DN）、miR-146a-5p 陰性對照組（mimic 對照組）和miR-146a-5p mimic 處理組（mimic 處理組）。后2組糖尿病腎病大鼠分別經尾靜脈分別注射慢病毒包被的miR-146a-5p mimic mock 和miR-146a-5p mimic 序列（上海吉瑪基因），每周2次，共8周，正常對照組和模型組同一時間注射等量生理鹽水。

1.4 血清及樣品采集

實驗結束最后一天，首先測量各組大鼠24 h 內飲水量和尿量，然后采用乙醚麻醉處死大鼠，從腹主動脈中采集血樣，離心血液，血清于－80℃保存；收集右腎，快速冷凍，－80℃保存；左腎保存于4%多聚甲醛溶液中，進行組織學分析及細胞凋亡檢測。

1.5 全自動生化分析儀檢測尿液中尿蛋白，血液中血脂、血糖、尿素氮和血清肌酐含量

實驗結束最后1 d，使用代謝籠收集尿液樣本，采用全自動生化分析儀測定尿白蛋白濃度；并用全自動生化分析儀檢測大鼠血清中FBG、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）和肌酐（serum creatinine，Scr）含量。

1.6 H-E染色觀察腎小球組織損傷

4%多聚甲醛溶液固定腎組織24 h 以上，用水和乙醇梯度洗脫，二甲苯脫醇，石蠟包埋。石蠟切片，二甲苯透明，乙醇和水梯度洗脫。然后經脫蠟、蘇木精液染色、1% 鹽酸乙醇分化、0.6% 氨水返藍、0.5% 伊紅液染色后，再常規脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在400倍顯微鏡下觀察腎損傷情況。

1.7 TUNEL染色檢測腎組織細胞凋亡

4%多聚甲醛溶液固定的腎組織進行石蠟包埋、切片和脫水，然后與含有TdT 和生物素化dUTP的TUNEL 反應混合物37℃孵育1 h。在37℃的洗滌緩沖液中孵育30 min 終止反應。在E600 光學顯微鏡下（日本東京尼康）以×200倍的放大倍數在8個隨機場中計數TUNEL 陽性細胞的數量。

1.8 免疫印跡檢測

用RIPA裂解緩沖液在4℃下提取腎組織蛋白質。使用BCA蛋白質測定試劑盒定量蛋白質濃度。用12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對等量蛋白質（30 μg）進行電泳，然后轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）（Millipore）上。在TBST 溶解的5%脫脂牛奶中封閉1 h后，用稀釋的一 抗cas3（1∶500）、cleaved cas3（1：500）、Bcl-2（1∶1 000）、Bax（1∶1 000）、β-actin（1∶2 000）、iNOS（1∶500）和IL-10（1∶500）4℃孵育過夜。然后，將膜與辣根過氧化物酶結合的二抗（1∶2 000）37℃孵育2 h，并使用增強化學發光試劑ECL 顯示條帶，用ChemiDoc 圖像分析儀（中國上海天能）定量蛋白灰度值。

1.9 ELISA檢測大鼠血清中TNF-α、iNOS和IL-6的水平

按照ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清中TNF-α、iNOS和IL-6 等炎性細胞因子的含量。

1.10 統計學處理

所有結果均以±s表示。使用SPSS 18.0 軟件進行數據統計分析，2組之間差異采用未配對t檢驗進行分析。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MiR-146a-5p對DN模型大鼠生理生化指標的影響

結果顯示（表1、2），與正常對照組相比，模型組大鼠體質量明顯降低（P＜0.05），血糖水平、飲水量及尿量明顯增加（P＜0.05），與糖尿病腎病患者癥狀符合，TG 和TC含量也顯著升高；與模型組相比，mimic 處理組大鼠體質量有明顯增加，飲水量和尿量顯著減少（P＜0.05），FBG、TG 和TC含量也明顯降低（P＜0.05），mimic 對照組各指標沒有明顯變化。

表1 大鼠體質量、飲水量和尿量指標測定（n=10，±s）

表1 大鼠體質量、飲水量和尿量指標測定（n=10，±s）

*P＜0.05vs正常對照組；#P＜0.05vs模型組

組別 體質量（g）飲水量（mL/24 h）尿量（mL/24 h）正常對照組 504.26±32.42 43.12±9.43 10.91±6.53模型組 363.18±48.23*236.34±39.71*106.34±29.21*Mimic 對照組 367.64±55.05 218.02±54.12 108.62±36.89 Mimic 處理組 448.93±40.84# 107.18±42.92# 41.83±12.07#

表2 大鼠空腹血糖、甘油三酯和膽固醇指標測定（n=10，±s，mmol/L）

表2 大鼠空腹血糖、甘油三酯和膽固醇指標測定（n=10，±s，mmol/L）

*P＜0.05vs正常對照組；#P＜0.05vs模型組

組別 FBG TG TC正常對照組 4.02±1.18 0.41±0.12 1.14±0.62模型組 19.64±5.21*0.75±0.15*1.92±0.40*Mimic 對照組 20.26±3.56 0.77±0.14 1.86±0.46 Mimic 處理組 10.04±1.29# 0.49±0.08# 1.47±0.30#

2.3 MiR-146a-5p可降低DN大鼠腎損傷標志物含量

結果顯示（表3），模型組大鼠尿蛋白、尿素氮和肌酐水平相較于正常對照組有明顯的升高（P＜0.05），而mimic 處理組能顯著下調模型組大鼠較高的尿蛋白、尿素氮和肌酐水平（P＜0.05）；mimic 對照組與模型組比較差異無統計學意義。

表3 尿白蛋白、血清尿素氮和肌酐的檢測（n=10，±s）

表3 尿白蛋白、血清尿素氮和肌酐的檢測（n=10，±s）

*P＜0.05vs正常對照組；#P＜0.05vs模型組

組別 尿蛋白（mg/L）BUN（mmol/L）Scr（μmol/L）Control 7.19±2.51 5.02±0.34 51.44±8.25模型組 56.32±14.19*21.18±7.19*79.84±12.86*Mimic 對照組 54.78±11.93 20.52±5.66 82.33±11.21 Mimic 處理組 19.11±7.64# 10.64±3.46# 57.65±9.49#

2.4 MiR-146a-5p可減輕DN大鼠腎組織病變損傷

結果顯示（圖1），正常對照組大鼠腎小球形狀規則，細胞排列整齊、輪廓清晰，未觀察到炎性細胞的浸潤；糖尿病腎病大鼠腎小球體積增大，基底膜明顯擴張，伴有大量炎性細胞的浸潤；與模型組相比，mimic 對照組大鼠腎組織無變化，mimic處理組大鼠腎小球基底膜擴張、體積腫脹及炎性細胞的浸潤顯著減輕。

圖1 H-E染色觀察腎小球及周圍組織病變，×400，標尺=25 μm。圖中黑色箭頭為基底膜，紅色箭頭所指為炎癥細胞浸潤，圖B 較圖A基底膜增厚，出現大量炎癥細胞浸潤，圖D 較圖B 基底膜變薄，炎性細胞的浸潤減少。A：正常對照組；B：模型組；C：Mimic 對照組；D：Mimic 處理組.

2.5 MiR-146a-5p可抑制DN大鼠誘導的腎細胞凋亡

結果顯示（圖2），與正常對照組相比，糖尿病腎病大鼠腎組織中凋亡細胞數目（棕色）明顯增加，包括基底膜外側的足細胞，Bax/Bcl-2 比值和cleaved cas3表達顯著上調（P＜0.05）。與模型組相比，mimic 處理組凋亡細胞數目明顯減少，Bax/Bcl-2 比值和cleaved cas3表達顯著下調（P＜0.05），mimic 對照組無顯著變化。

圖2 各組大鼠腎組織凋亡變化，標尺=50 μm。A～D：TUNEL染色，×200，標尺=50 μm。A：正常對照組；B：模型組；C：Mimic 對照組；D：Mimic 處理組.E：cas3，Bax and Bcl-2 在腎組織的表達。*P＜0.05vs正常對照組；#P＜0.05vs模型組.

2.6 MiR-146a-5p可抑制DN大鼠誘導的炎癥反應

結果顯示（表4，圖3），與正常對照組相比，糖尿病腎病大鼠血清中炎癥細胞因子TNF-α、iNOS、IL-6和IL-10的水平顯著升高（P＜0.05），腎組織中iNOS和IL-10蛋白表達顯著上調（P＜0.05）；mimic 處理組促炎因子TNF-α、iNOS和IL-6的水平顯著降低，抗炎因子IL-10的水平顯著升高（P＜0.05），腎組織中iNOS蛋白表達顯著下調，IL-10蛋白表達顯著上調（P＜0.05）；mimic 對照組與模型組相比，差異無統計學意義。

表4 ELISA檢測大鼠血清中促炎因子的表達水平（n=10，±s，pg/mL）

表4 ELISA檢測大鼠血清中促炎因子的表達水平（n=10，±s，pg/mL）

*P＜0.05vs正常對照組；#P＜0.05vs模型組

組別 TNF-α iNOS IL-6正常對照組 15.27±4.38 22.08±6.39 15.23±5.37模型組 134.85±35.23*208.12±31.45*86.58±17.43*Mimic 對照組 138.78±29.61 213.48±38.54 93.63±11.26 Mimic 處理組 65.49±16.57# 81.03±19.42# 42.13±9.28#

3 討論

DN 是糖尿病的重要并發癥，其特征是蛋白尿、高血壓、水腫和腎功能不全[13]，具有多種致病因素和有限的治療方案。因此，探討DN的發病機制對DN的預防具有重要意義。糖脂代謝紊亂、炎癥因子異常表達和足細胞凋亡被認為是DN的致病因素[14]。STZ誘導的DN大鼠模型已被廣泛應用于DN 發病機制的研究[15]。DN 主要影響腎小球，因此腎小球濾過功能障礙導致的蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平升高作為評估腎功能損害的重要參考指標[16-17]。本研究結果顯示，HFD/STZ誘導的DN大鼠體質量明顯下降，飲水量及尿量明顯增多，尿蛋白、血糖、血脂、血清肌酐和尿素氮水平顯著升高，表明DN大鼠腎功能損傷嚴重。MiR-146a-5p過表達可明顯改善大鼠體質量及大鼠各項生化指標，表明miR-146a-5p 能明顯減輕STZ誘導的DN大鼠腎功能損傷。

研究表明DN的關鍵臨床標志物蛋白尿在miR-146a-/-糖尿病小鼠中顯著增加，且miR-146a的缺失導致腎小球面積明顯增大[18]，證明miR-146a 在DN的發展過程中起到保護作用。Lee 等[19]研究表明足細胞中miR-146a 缺失增加了糖尿病腎小球病變的風險。本研究結果顯示STZ誘導的DN大鼠腎小球體積增大，基底膜明顯擴張，并伴有大量炎性細胞的浸潤，miR-146a-5p過表達可顯著改善腎小球損傷，因此miR-146a-5p 在DN 發展過程中起到負調控作用。

足細胞的損傷和功能障礙是腎小球疾病的標志[20]。MiR-146a 在足細胞中高度表達[21]，表明它在維持足細胞健康中具有重要作用。MiR-146a表達水平在2型糖尿病（T2D）患者的腎小球中降低，這與白蛋白尿和腎小球損害增加有關[19]。本研究結果顯示miR-146a-5p過表達可明顯逆轉DN大鼠造成的腎小球細胞凋亡增加，Bax/Bcl-2 比值和cleaved cas3表達上調。因此miR-146a-5p可通過抑制細胞凋亡阻止DN的發展。

炎癥被認為是DN 病理生理的重要起因，某些細胞因子，例如核因子-κB（NF-κB）、IL-6和TNF-α 在炎癥反應中起著至關重要的作用[22]。IL-6和TNF-α 均可促進巨噬細胞活化，并誘導腎小球膜細胞增殖[23]。研究表明miR-146 可抑制NF-κB 信號通路，降低TNF-α、IL-1β 和IL-6的水平，對腎損傷起到保護作用[24]。本研究結果顯示，miR-146a-5p過表達可明顯上調抗炎因子IL-10的表達，下調促炎因子TNF-α、iNOS和IL-6的表達。因此miR-146a-5p通過抑制炎癥反應阻止DN的進展。

綜上，本研究結果表明miR-146a-5p可通過降低HFD/STZ誘導的DN大鼠一系列生理生化指標，改善腎小球濾過功能，抑制腎細胞凋亡及炎癥反應對腎損傷起到保護作用。總而言之，本研究結果提示miR-146a 在DN的發病機制中以及作為疾病進展的生物標志物方面具有新的作用。