兩種小鼠生精細胞染色體制備方法的探討與評價*

盧文亮 孟衛京 薛春梅 楊 靜 寧偉霞 毛國麗 郭興萍

（山西省生殖科學研究所，太原 030006）

生精細胞減數分裂期染色體分析是遺傳學、組織學胚胎學、細胞生物學和生殖生物學研究的重要手段[1-2]。染色體是基因的載體，真核細胞染色體的數目和結構是重要的遺傳指標之一[3-4]，優良的染色體制片是進行染色體顯帶、組型分析、原位雜交等的先決條件。目前，常規的減數分裂期染色體制備方法大體分為兩類：體內注射秋水仙素法[5-6]和空氣干燥直接制備法[7]。常規方法制作的小鼠生殖細胞減數分裂玻片標本，分裂的大部分細胞處于第一次減數分裂前期I的部分時期，如細線期、偶線期和粗線期。中期分裂相細胞少，染色體短而不清晰，背景模糊，不易觀察且重復性差、不穩定。筆者參考Evans 等[2，7-12]的方法，優化了部分實驗條件，采用改良的體內注射秋水仙素法和空氣干燥直接制備法制備小鼠生精細胞減數分裂染色體，均獲得理想的效果，現報告如下。

1 材料和方法

1.1 動物與試劑

Balb/c小白鼠，雄性，8～12周齡，25～30 g，山西醫科大學實驗動物中心提供。秋水仙素購自廣州白云山拜迪生物醫藥有限公司；Giemsa 染液購自北京易世盛達科技發展有限公司，0.4%KCl、甲醇∶冰乙酸固定液（3∶1）、2.2%檸檬酸鈉、1%檸檬酸鈉、0.9%NaCl 等為常規分析純配制。

1.2 改良的體內注射秋水仙素制備法

改良的體內注射秋水仙素制備法在王彬和陳曉東等[2，10]方法基礎上進行。雄性小鼠以4 mg/kg腹腔注射秋水仙素，經6 h后，頸椎脫臼法處死小鼠，取出睪丸，去除白膜，用0.9% NaCl液洗去血污，放入裝有2 mL 0.4% KC1液的5 cm培養皿中剪碎（呈乳白色），并輕輕吹打，使生精小管中的各級生精細胞釋放出來。用70 μm 過濾器過濾到15 mL 刻度離心管中，再加0.4% KC1液至10 mL，37℃靜置30 min，進行低滲處理。800～1 000 r/min離心8 min，棄上清；加入10 mL 甲醇冰乙酸固定液（3∶1）輕輕混勻，37℃固定10 min；重復2次。留少許上清液，制成細胞混懸液，取潔凈的低溫預冷載片，梯度滴片、染色并鏡檢，尋找分散良好、染色適中的分裂相，高倍鏡下觀察染色體形態，并計數。

1.3 改良的空氣干燥直接制備法

改良的空氣干燥直接制備法在Evans等[7-9，13]方法基礎上進行。脫臼法處死小鼠，取出睪丸，去除被膜和附著的脂肪，并用等滲室溫的2.2%檸檬酸鈉溶液洗去血污。將睪丸轉移到新鮮的2.2%檸檬酸鈉溶液中，將生精小管拉出來，用剪刀剪碎，并用合適的尖銳的彎鑷子徹底撕扯生精小管，直到管不透明和平坦為止。將上清液轉移到15 mL離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清液。將沉淀細胞用3 mL 1%檸檬酸鈉重懸，室溫條件下低滲處理12 min。1 000 r/min離心5 min，棄上清液。用拇指或示指輕彈來重懸細胞，以便在管壁上形成薄膜，快速加入0.25 mL甲醇冰乙酸固定液，輕彈混勻，然后逐滴緩緩加固定液到2 mL。室溫下固定3次，每次10 min。用移液管吸取少許懸液，將懸液在室溫下進行不同濃度梯度滴片。用PBS（pH 7.4）配制的10%Giemsa染色10～20 min，并鏡檢。

1.4 M期、MⅠ期和MⅡ期細胞分裂相計數及檢出率計算

體內注射法每個秋水仙素濃度（4、6、8 mg/kg）用3只小鼠制片，直接制備法用3只小鼠制片。每只小鼠制片6張，3個細胞濃度梯度，選取其中最適濃度梯度的2 張可供分析的標本片進行觀察，并計數分析。標準為：染色體分散良好，長度適中，背景清晰，精原細胞有絲分裂中期（M期）染色體數目40個，初級精母細胞減數第1次分裂中期（MⅠ期）二價體數目20個，次級精母細胞減數第2次分裂中期（MⅡ期）染色體數目20個。在每只小鼠的2 張玻片上計數1 000個分裂相（每張玻片500個，2張），分別統計減數分裂過程中M期、MⅠ期和MⅡ期分裂相的數目，并計算檢出率。

1.5 統計學處理

采用SPSS 19.0 軟件對數據進行統計學分析，計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 生精細胞中期染色體比較

體內注射秋水仙素法獲得的生精細胞染色體多為第1次減數分裂前期，呈細長形，并且邊緣發毛，不需顯帶處理即可顯示帶紋，其次為精原細胞有絲分裂中期（M期），減數第1次分裂中期（MⅠ期）和減數第2次分裂中期（MⅡ期）的細胞較少（圖1）。經空氣干燥直接制備法獲得的生精細胞染色體主要為初級和次級精母細胞分裂相，精原細胞分裂相少見，染色體明顯呈粗短形，形態清晰，共40條，初級精母細胞MⅠ期染色體為二價體，多進行聯會配對，呈“+”或環狀，共有40條染色體，形成19個常染色體和1個X/Y 配對的性染色體二價體，性染色體二價體呈不對稱，這與李建民等[14]報道一致。次級精母細胞MⅡ期染色體稍細長，姐妹染色單體未分離，邊緣不整齊，Giemsa染色均勻，共20條。空氣干燥直接制備法制備時間較短（圖1）。

2.2 M期、MⅠ期MⅡ期細胞分裂相比例分析

用2種方法制備生精細胞染色體較常規制片方法均顯著增加，可觀察到許多處于分裂中期的染色體，可以進行染色體組型分析。在1 張標本片中，可供實驗分析的3種不同階段的睪丸生殖細胞染色體分裂相，體內注射秋水仙素法可觀察到200～300個，直接制備法為140～200個。秋水仙素的最佳劑量是4 mg/kg，隨著秋水仙素濃度的升高，減數分裂各期的分裂相減少，8 mg/kg 秋水仙素處理只能得到少數的M期分裂相，減數分裂前期分裂相驟減，空氣干燥直接制備法制得的減數分裂中期分裂相數目比4 mg/kg 秋水仙素處理后減少，差異有統計學意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 不同發育階段的小鼠睪丸生精細胞中期染色體，Giemsa染色，×1 000，標尺=2 μm

表1 兩種方法計數1 000個分裂相中各中期細胞比例（n=3，±s）

表1 兩種方法計數1 000個分裂相中各中期細胞比例（n=3，±s）

▲分裂相較少，計數總數為100個分裂相；ND：無檢出。*P＜0.05，**P＜0.01 vs 空氣干燥法

方法 劑量(mg/kg) 每只動物平均數 中期細胞得率（%）M MⅠ MⅡ直接制備法 13.7±3.2 27.6±2.5 23.3±3.5 6.46秋水仙素法 4 22.3±2.1*42.3±3.6** 39.0±2.6** 10.37 6 25.3±1.5 9.3±1.2 12.6±2.5 4.73 8 4.6±1.2▲ ND ND ND

3 討論

染色體制備技術是遺傳學領域的一項關鍵基礎技術，其中應用最成熟的是人外周血染色體制備及分析，已應用于臨床診斷與分析[15]。小鼠睪丸細胞染色體制備技術為人睪丸細胞染色體制備提供技術基礎，具有潛在應用價值，但由于睪丸細胞染色體制備過程復雜，影響因素多，在實際操作過程中要同時獲得理想的3種中期染色體成功率很低，因此需要進一步改進優化。

本研究比較了秋水仙素注射法和空氣干燥直接制備法制備小鼠睪丸細胞染色體，并討論了制備過程中的注意事項和改進方法。關于秋水仙素濃度，當低滲液為0.4%KCl溶液時，用不同濃度秋水仙素（4、6 mg/kg 和8 mg/kg）處理，結果顯示秋水仙素的最適濃度為4 mg/kg，這與蘇愛等[17]報道一致。隨著濃度的增加，中期的細胞數量減少，這可能與高濃度秋水仙素法易破壞著絲點，導致細胞分裂相減少有關。當低滲液為1%檸檬酸鈉時，秋水仙素為0，即直接制備的效果要好，而6 mg/kg 和8 mg/kg 秋水仙素用量時分裂相很少。

關于去被膜及剪碎過程中緩沖液的使用，本研究認為等滲溶液即2 %檸檬酸鈉溶液最為合適，可避免在剪碎過程中損傷生精細胞，影響分裂相得率。關于撕碎方式，本研究先用剪刀剪碎，再用1 mL注射器撕碎，撕碎后靜置，輕輕吹打100余次，以便使更多的單細胞從曲細精管中釋放出來。關于消化處理，王治喬等[19]報道用1%胰酶消化可以得到更多的中期細胞數，Hoo 等[8]報道用60%乙酸軟化曲細精管可獲得更多的中期細胞，但胰酶和乙酸均可使染色體邊緣發毛，不整齊。本研究為得到邊緣輪廓清晰的染色體而未采用此方法，同樣獲得了足夠量的各級生精細胞，且邊緣輪廓清晰。

本研究利用70 μm 細胞濾器過濾，可去除大塊組織，增加制片效果。關于低滲及固定條件，本研究結果顯示低滲條件為37℃30 min，固定條件為卡諾固定液（甲醇∶冰乙酸3∶1）固定2次，每次10 min，且加入固定液后迅速混勻，實驗結果最佳。關于離心速度，本研究結果顯示離心轉速1 000～1 500 r/min為宜，＞2 000 r/min時，未成熟的精子細胞就會沉淀下來，影響實驗觀察。梯度滴片法（將懸液進行不同濃度梯度的滴片）可以很好提高可供分析的分裂相的數量，成功率比單一的濃縮液滴片效果要好，值得推廣。

綜上所述，通過對2種染色體制備方法進行改進及比較表明，體內注射秋水仙素法可以得到較多的分裂相，而在制備的質量上，空氣干燥直接制備法更容易得到輪廓清晰和便于分析的染色體核型，在今后應用中可根據實驗需求進行靈活選用。