離心沉淀法制備細(xì)胞透射電鏡樣品的技術(shù)改進(jìn)*

陳彥儒 王立言 郝 晶 劉尚明 張向紅△

（1 山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，濟(jì)南 250012；2 山東第一醫(yī)科大學(xué)，濟(jì)南 250022）

細(xì)胞樣品制備超薄切片通常采用離心沉淀法，即將細(xì)胞懸浮后離心，積聚成團(tuán)塊，再進(jìn)行常規(guī)電鏡制樣。這種方法要求有足夠的細(xì)胞數(shù)量且細(xì)胞團(tuán)塊比較牢固，否則會因?yàn)槌恋砦锾匐y以轉(zhuǎn)移到包埋模具中；而且由于包埋過程中換液次數(shù)較多，每次換液細(xì)胞團(tuán)都會被沖散，因此，對于細(xì)胞數(shù)量不夠多的樣本，比如通常條件下難以生長的培養(yǎng)細(xì)胞、臨床送檢的血液及胸腹水標(biāo)本等，多次離心后很難得到足夠的細(xì)胞樣品，最終導(dǎo)致制樣失敗。本室為長期對外開放的服務(wù)單位，服務(wù)過程中會接觸到大量的細(xì)胞樣品，這些樣品有的是由于收集困難導(dǎo)致送檢的細(xì)胞數(shù)量本來就很少，有的由于各種原因?qū)е录?xì)胞不易聚集成團(tuán)。很多標(biāo)本取材不易，非常珍貴，制樣失敗會給送樣者造成不可挽回的損失。為解決這些問題，筆者通過長期摸索，對利用離心沉淀法制備細(xì)胞透射電鏡樣品積累了一定的經(jīng)驗(yàn)，報(bào)告如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣品

均來自技術(shù)服務(wù)過程中送樣的細(xì)胞樣品，包括體外培養(yǎng)細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、成骨細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等以及細(xì)菌等微生物，血液、骨髓、胸腹水等液體中分離出來的細(xì)胞等有形成分。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

戊二醛、鋨酸等固定劑，Ep812環(huán)氧樹脂等包埋劑，醋酸雙氧鈾，檸檬酸鉛等染色劑，均購自北京中鏡科儀器有限公司。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫干燥箱，英國劍橋ULTRCUT E型超薄切片機(jī)，日本電子1200EX型透射電子顯微鏡。

1.4 細(xì)胞的收集

培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞通常采用胰酶消化或刮除離心法，懸浮培養(yǎng)或其他含有游離細(xì)胞的液體直接離心。將含有細(xì)胞的液體倒入1.5 mL的尖底離心管中，根據(jù)不同的細(xì)胞類型選擇不同的離心速度和時(shí)間，一般是以1 000～3 000 r/min離心10～15 min。如果細(xì)胞過于分散，液體太多，可先在普通離心管中低速離心數(shù)分鐘，去掉上清，將下層濃縮的液體轉(zhuǎn)移到1.5 mL的尖底離心管中再次離心。

1.5 固定與清洗

離心后的樣品去掉上清，立即加入3%的戊二醛，放入4℃冰箱內(nèi)固定保存（至少2 h以上）。經(jīng)過一定時(shí)間后或收集到一定數(shù)量的樣品后，再開始集中包埋。先用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液清洗2次，每次10～15 min，1%的鋨酸4℃冰箱內(nèi)固定1 h，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液清洗2次，每次10～15 min。

鋨酸固定過程中對樣品進(jìn)行分類，細(xì)胞數(shù)量多且團(tuán)塊比較緊密，用牙簽沿管壁輕輕撥動將細(xì)胞團(tuán)懸浮，按常規(guī)樣品處理，其他樣品進(jìn)行分組；（1）細(xì)胞團(tuán)塊比較疏松，換液時(shí)可能會被沖散或有少量細(xì)胞丟失，在鋨酸固定后將細(xì)胞包裹在擦鏡紙中放入青霉素小瓶中進(jìn)行后續(xù)處理（圖1）；（2）細(xì)胞團(tuán)塊非常小，只在離心管底部可見少量沉淀物，在后續(xù)更換液體時(shí)要注意避免吸管觸碰到細(xì)胞，沿管壁緩緩加入新液，避免水流太急將細(xì)胞打散；（3）前2組中各留取1個(gè)樣品按常規(guī)方法進(jìn)行處理，作為對照組。

圖1 擦鏡紙包裹樣品的過程

1.6 脫水與浸透

所有樣品均采用梯度脫水法，30%、50%、70%、90%的乙醇，90%乙醇：90%丙酮=1∶1混合液，90%的丙酮、100%丙酮脫水2次，每次10～15 min；浸透亦梯度進(jìn)行，包埋劑：100%丙酮（1∶3、1∶1、3∶1）分別浸透1、4、12 h以上。

1.7 包埋與聚合

第1組樣品，將擦鏡紙打開，用牙簽將其中的細(xì)胞團(tuán)塊轉(zhuǎn)移到包埋模具中；第2組樣品將浸透液去除干凈后，直接加入純包埋劑至離心管的1/3～1/2處；對照組2個(gè)樣品，其中一個(gè)在脫水過程中細(xì)胞完全丟失，另一個(gè)僅余針尖大小的細(xì)胞團(tuán)，按常規(guī)方法轉(zhuǎn)移至包埋模具中。包埋后在恒溫干燥箱中升溫聚合。聚合溫度與時(shí)間分別為：37℃，12 h；45℃，12 h和60℃，24～48 h。

1.8 超薄切片

聚合后的樣品包埋塊在ULTRCUT E型超薄切片機(jī)上制備50～70 nm的超薄切片。第1組樣品，按常規(guī)修塊、切片；第2組包埋在離心管中的樣品，先用單面刀片將離心管切開，取出其中的包埋塊，再進(jìn)行修塊、切片；第3組樣品一個(gè)沒有得到包埋塊，另一個(gè)因殘留組織太少，不能滿足修塊、切片的要求，沒有進(jìn)行超薄切片。

1.9 電子染色

將1、2組樣品的超薄切片采用滴染法進(jìn)行醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛雙染色，先用醋酸雙氧鈾鈾染30 min，雙蒸水沖洗干凈后，再用檸檬酸鉛鉛染15 min，雙蒸水沖洗。

1.10 電鏡觀察

染色后的超薄切片充分干燥后用日本電子1200EX型透射電子顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

用擦鏡紙包裹及直接在離心管包埋的2組樣品均能得到有效包埋塊。微量細(xì)胞樣品在整個(gè)操作過程中幾乎未觸碰細(xì)胞，基本杜絕了細(xì)胞離散；細(xì)胞數(shù)量和聚集程度均能滿足超薄切片需要，包埋塊切割性能良好，沒有發(fā)生切片困難或切片破碎等現(xiàn)象（圖2）；電鏡下觀察細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)保存完好，結(jié)構(gòu)清晰，低倍下可見細(xì)胞數(shù)量多且呈單個(gè)均勻分布，細(xì)胞之間有一定的間隙，沒有擠壓重疊，也沒有因?yàn)殡x心而導(dǎo)致細(xì)胞擠壓變形（圖3）。按常規(guī)方法處理的對照組由于細(xì)胞丟失無法得到有效的包埋塊，不能進(jìn)行超薄切片，導(dǎo)致制樣失敗（圖4）。

圖2 Ependorf 管樣品（A）和擦鏡紙包裹樣品的包埋塊及完整切片（B）.

圖3 前2組樣品在透射電鏡下的觀察結(jié)果。A：高倍鏡下透射電鏡圖；B：低倍鏡下完整細(xì)胞的透射電鏡圖，bar=2 μm.

圖4 對照組包埋的樣品太小（箭頭所指）時(shí)，無法修塊和切片.

圖5 瓊脂包埋后切片超薄切片和透射電鏡圖片

3 討論

細(xì)胞樣品中由于細(xì)胞體積較小，且有時(shí)候數(shù)量又少，另外由于收集細(xì)胞方式的多樣化，給電鏡樣品的制備帶來一定的難度。尤其是胸、腹水，表皮下或深層組織的針吸細(xì)胞、外周血、骨髓穿刺以及精液等分散體系進(jìn)行電鏡制樣時(shí)，包埋前的處理更是困難，處理不當(dāng)極易造成樣品的分散和丟失[1]。對此，筆者曾采用瓊脂預(yù)包埋的方法，或加入血漿及牛血清白蛋白的方式以增加細(xì)胞的黏附性[2-3]。這些方法操作比較復(fù)雜，不太適用于大批量樣品的制備，有時(shí)候還會因?yàn)闇囟劝芽夭划?dāng)，容易造成細(xì)胞變形。另外，由于細(xì)胞在瓊脂及血清蛋白中呈散在分布，電鏡下能夠觀察到的細(xì)胞數(shù)量較少。瓊脂及血清蛋白等非細(xì)胞成分的存在還會導(dǎo)致樣品內(nèi)部硬度不同而造成切片困難或標(biāo)本破碎[4]（圖5）。采用擦鏡紙包裹離心沉淀物的方法操作簡單[5]，但如果在鋨酸固定之前進(jìn)行會增加鋨酸的用量，造成試劑浪費(fèi)。

筆者根據(jù)多年工作的經(jīng)驗(yàn)，將樣品依據(jù)離心沉淀物的大小和前固定后清洗的情況進(jìn)行分類處理，使所有樣品都能得到滿意的結(jié)果。對微量細(xì)胞樣品采取在離心管中直接包埋的方法，使離心后的細(xì)胞不做任何移動，既能使操作達(dá)到最簡，又能防止細(xì)胞丟失；對易分散的樣品在鋨酸固定后用擦鏡紙包裹離心沉淀物，既不增加鋨酸的用量，又避免擦鏡紙被鋨酸固定后變黑不易辨別其中的細(xì)胞；對滿足常規(guī)制樣要求的細(xì)胞進(jìn)行懸浮，有利于鋨酸的固定及脫水劑的滲透。因此筆者的方法對所有樣品均不添加任何介質(zhì)，既不影響包埋塊的切割性能，又有利于電鏡觀察。

在長期的對外服務(wù)工作中，針對各種樣品的制備摸索出了下面的經(jīng)驗(yàn)。①對于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，懸浮后會破壞細(xì)胞的生長狀態(tài)，要觀察細(xì)胞在生存狀態(tài)下的形態(tài)，不適合用離心沉淀法的樣品，需要進(jìn)行原位包埋[6]。②對于預(yù)知離心沉淀物太少不能達(dá)到常規(guī)制樣要求時(shí)，可用1 mL乃至0.5 mL的尖底離心管離心，有利于聚合后的修塊。不建議全部使用1 mL或0.5 mL的離心管，以免固定液及脫水劑用量太少，影響固定及脫水效果。③關(guān)于消化離心法，雖然操作方便簡單，但會造成細(xì)胞外形、表面及內(nèi)部結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化；刮除離心法可保留大部分細(xì)胞的形態(tài)及細(xì)胞間關(guān)系，細(xì)胞排列有序，有明顯的細(xì)胞間連接[7]。指導(dǎo)送樣者收集細(xì)胞時(shí)，推薦使用刮除離心法。④刮除細(xì)胞時(shí)最好采用自制的橡膠刮，方法是剪一塊青霉素小瓶的瓶蓋，用止血鉗夾住弧形的一邊，用另一端的平面緊貼培養(yǎng)瓶沿一個(gè)方向輕輕刮除細(xì)胞，1個(gè)位置只刮1遍。不建議使用金屬刮，以免將細(xì)胞刮破或使鐵屑留在樣品中影響切片。⑤離心參數(shù)直接影響樣品的收集及后續(xù)操作，細(xì)胞量過少或黏附性差時(shí)，有時(shí)候不得不增加離心速度和時(shí)間，但這對超微結(jié)構(gòu)的破壞也必然隨之增加。離心參數(shù)的選擇與操作人員的經(jīng)驗(yàn)有關(guān)[8]，筆者推薦使用的離心參數(shù)為1 000～3 000 r/min離心10～15 min，這種條件下，細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)保存良好，也不易發(fā)生細(xì)胞離散或者不能包埋的情況。⑥細(xì)胞中有雜質(zhì)，如果細(xì)胞中有雜質(zhì)，離心后細(xì)胞團(tuán)底部會有黑色物，可經(jīng)戊二醛固定后取出細(xì)胞團(tuán)，在顯微鏡下用刀片切掉[9]；如果細(xì)胞太少不能做到，切片時(shí)不能用鉆石刀片，以免損壞刀口。這時(shí)可以采用玻璃刀切片，這樣可能會產(chǎn)生刀痕，但只要用孔徑較小的載網(wǎng)撈片，在電鏡下仔細(xì)觀察仍能找到完整的細(xì)胞，不會影響超微結(jié)構(gòu)分析。⑦直接在離心管中包埋的樣品，包埋劑不要加太多，如果聚合后包埋塊太大，裝在超薄切片機(jī)的樣品夾中露出太多，可先用刀片或挫刀將包埋塊底部修去一部分，避免超薄切片出現(xiàn)顫痕。