發酵乳中生物活性肽的研究進展

洪 青，劉振民

（乳業生物技術國家重點實驗室，上海乳業生物工程技術研究中心，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海 200436）

發酵乳是由保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌及其他乳酸菌共同發酵制備的乳制品。乳酸菌具有豐富的胞內蛋白酶及運輸系統組成的蛋白水解酶系，能夠將完整乳蛋白水解成小分子的多肽和氨基酸。其中，生物活性肽是一類具有益生生理功能的多肽類化合物，對宿主生理代謝與免疫調節具有重要作用。生物活性肽大小不一，一般是由2～20 個氨基酸組成的短肽段。乳源生物活性肽因活性強、天然來源、易制備等優勢，成為乳品領域的研究熱點之一[1]。目前主要通過不同酶解或乳酸菌水解獲得，不同的發酵菌株可以產生各種形式的生物活性肽，包括抗氧化肽、降血壓肽、免疫調節肽、抗菌肽及阿片活性肽等，具有調控抗氧化應激、調節心血管系統、免疫系統、神經系統及胃腸道系統功能等生理功能[2-4]。

1 乳酸菌的蛋白水解系統

乳酸菌的蛋白水解系統主要包括：1）一種或多種細胞壁蛋白酶，也稱為細胞包膜蛋白酶（cell envelope proteinase，CEP），能夠將乳蛋白水解成含有4～30 個殘基的肽；2）肽的轉運系統，包括寡肽結合蛋白、2 個形成孔的通透酶和2 個供能的ATPases；3）多肽降解為氨基酸所必需的細胞內肽酶。CEP是乳酸菌蛋白水解的主要參與者，由6～8 個功能結構域組成。其中，PP結構域包括信號肽和前肽；PR結構域包含由天冬氨酸、絲氨酸和組氨酸殘基組成的特定催化三元結構域；最終插入I結構域，負責調節CEP的底物特異性；A結構域保守性差，參與調節蛋白水解活性，影響PR結構域的特異性；在乳球菌和乳桿菌中發現B結構域，與酶活性和酶空間結構特異性的穩定有關；H螺旋結構域參與胞外A和B結構域的正確定位；W結構域作為細胞壁間隔物，可以作為蛋白酶的結合結構域；AN結構域是錨定結構域，但并不是所有細胞壁蛋白酶中都存在[5]。目前共發現5 種CEP，分別為PrtP、PrtS、PrtH、PrtB和PrtR，這些CEP包含不同數量的結構域，如PrtS中沒有B域，PrtR中沒有I域，PrtH和PrtB中沒有AN域[6]。影響CEP表達及乳蛋白釋放生物活性肽能力的因素包括酶底比、培養基組成、溫度、酸堿度和碳氮比等[7]。研究10 株嗜熱鏈球菌活性CEP對αs1-、αs2-、β-酪蛋白的降解結果發現，具有高度蛋白水解能力的菌株降解酪蛋白產生最多的肽，β-酪蛋白＞αs2-酪蛋白＞αs1-酪蛋白，其中有20 個肽具有生物活性，15 個肽為血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制劑，其他肽為免疫調節肽和抗菌肽[8]。

2 抗氧化肽

宿主細胞代謝時，部分氧被還原成活性氧（reactive oxygen species，ROS），包括過氧化物、氧離子和含氧自由基等，由于ROS中存在未成對的自由電子，極其不穩定，具有較高的氧化活性。當機體受到刺激時，ROS的生態平衡遭到破壞，導致體內ROS過載，出現氧化應激現象，進而導致脂質氧化、DNA氧化損傷和蛋白表達異常等，誘發高血脂、動脈粥樣硬化和心腦血管疾病等。

抗氧化肽的作用機理是清除自由基，在所選的抗氧化體系中，自由基清除能力可以通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-聯氮雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基和羥自由基清除能力、鐵離子還原能力以及抑制脂類物質氧化能力等體現。抗氧化肽的活性與其氨基酸組成、序列、結構及金屬鹽絡合相關。抗氧化肽一般由20 個以下氨基酸殘基組成，同時末端含有苯丙氨酸、丙氨酸、亮氨酸和纈氨酸等疏水性氨基酸時，抗氧化性增強[4]。此外，酸性氨基酸可以通過側鏈羧基螯合金屬離子，鈍化金屬離子的氧化作用，也能起到抗氧化作用[9]。

陳姍[10]利用復配菌種（保加利亞乳桿菌LB-12、嗜熱鏈球菌ST-Body-2、植物乳桿菌Vege-Start 2.0 CN、副干酪乳桿菌431和鼠李糖乳桿菌Fresh Q2）制備的發酵乳中多肽的抗氧化活性均高于單一菌株發酵乳，復配菌種發酵乳中，DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率分別達到51.3%和90.7%，金屬離子還原能力和螯合能力分別為496.5 nmol/L TE和94.22%，抗氧化能力綜合評價最強，鑒定得到42 條抗氧化肽序列。Tonolo等[11]從發酵乳中富集純化出23 條多肽，通過固相合成后測定體外和Caco-2模型中的抗氧化能力和作用機理，其中NTVPAKSCQAQPTTM、QGPIVLNPWDQVKR和APSFSDIPNPIGSENSE通過氧化還原敏感信號系統Kelch樣ECH相關蛋白1/核因子E2相關因子2（Kelch-like ECHassociated protein 1/nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Keap1/Nrf2）刺激Nrf2從胞質轉移至細胞核中，提高了抗氧化酶的過表達和活性。駱雨雨等[12]用瑞士乳桿菌S3、副干酪乳桿菌D21、乳酸乳球菌Y6和釀酒酵母菌K23混合制備發酵乳，結果表明，添加酵母的乳桿菌蛋白水解能力優于乳球菌，且制備的發酵乳抗氧化活性最高。Alo?lu等[13]發現，傳統手工制備的發酵乳中水溶性多肽比商業發酵乳具有更高的DPPH和ABTS陽離子自由基清除活性。Elfahri等[14]評估瑞士乳桿菌ASCC953、ASCC474、ASCC1188和ASCC1315菌株蛋白酶活性及其發酵乳抗氧化和體外抗腫瘤特性，結果表明，ASCC474發酵牛乳12 h后，發酵乳呈現出最高的DPPH自由基清除活性，發酵24 h時活性顯著降低，表明乳酸菌發酵牛乳產肽特性和活性表現出高度的菌株依賴性和時間依賴性。

3 降血壓肽

以ACE抑制肽為代表的降血壓肽是目前研究最多的活性肽之一。ACE主要通過腎素-血管緊張素系統和激肽釋放酶-激肽系統調節血壓。在腎素-血管緊張素系統中，ACE能將無升壓活性的十肽血管緊張素Ⅰ的C端二肽His-Leu切除，轉變為血管收縮劑血管緊張素Ⅱ，導致血壓升高；在激肽釋放酶-激肽系統中，ACE能夠切除舒緩激肽C端的二肽Phe-Arg，使其失活，最終導致血壓升高；因此，抑制ACE活性對于降低血壓極其重要[15]。

當肽中含有疏水性氨基酸和芳香族氨基酸時，會表現出較強ACE抑制活性。同時，當C末端為疏水性氨基酸殘基，則肽段的ACE抑制活性較高。如目前最典型的具有降血壓功能的活性肽纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸（Val-Pro-Pro）和異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸（Ile-Pro-Pro），由于肽段很短以及肽的C末端為疏水性氨基酸脯氨酸，因此很容易和ACE結合，抑制其活性。Gonzalez-Gonzalez等[16]利用兩歧雙歧桿菌MF20/5和瑞士乳桿菌DSM13137分別發酵牛乳后發現，兩歧雙歧桿菌MF20/5組產生一種新的ACE抑制肽LVYPFP和抗氧化肽VLPVPQK，瑞士乳桿菌DSM13137組總肽含量較少，但檢測出三肽纈氨酸-脯氨酸-脯氨酸（VPP）和異亮氨酸-脯氨酸-脯氨酸（IPP）；pH 4.6時，瑞士乳桿菌DSM13137組總肽含量與ACE抑制活性較高，兩歧雙歧桿菌能夠以較慢的產酸速率產生高含量的多肽，生產時無需控制pH值。乳酸明串珠菌PTCC發酵產生的多肽MVPYPQR具有抗氧化性和ACE抑制活性，該肽的作用機制是其C末端的Gln162和Arg之間存在氫鍵，同時該肽可以扭曲酶的Zn2+四面體幾何形狀[17]。采用糞腸球菌CECT5727制備的發酵乳中鑒定出2 種多肽：LHLPP和LVYFPGPIPNSLPQNIPP，半數抑制濃度（50% inhibition concentration，IC50）為5 μmol/L，以2 mg/kg劑量灌胃自發性高血壓大鼠時，2 種肽均表現出降血壓活性[18]。

其他乳源發酵乳中同樣也發現ACE抑制肽活性。Sathya等[19]接種4%植物乳桿菌NCDC379發酵山羊乳獲得最高的ACE抑制活性（97.55%），活性肽分子質量為1.4 kDa。Ayyash等[20]發現3 株益生菌株（羅伊氏乳桿菌KX881777、植物乳桿菌KX881772和植物乳桿菌KX881779）發酵駱駝乳比發酵牛乳有更高的蛋白水解和抗氧化活性，羅伊氏乳桿菌KX881777呈現出最高的ACE抑制活性，能夠抑制Caco-2、MCF-7和Hela細胞的增殖，表現出抗腫瘤活性。Maruyama等[21]發現，C端為Val-Ala-Pro的ACE抑制肽（IC50=2.0 μmol/L）的ACE抑制活性遠高于N端為Val-Ala-Pro的ACE抑制肽（IC50=550 μmol/L），但是C端為Phe-Val-Ala-Pro與N端為Phe-Val-Ala-Pro ACE抑制肽的ACE抑制活性接近，猜測ACE抑制肽C端倒數第3個氨基酸殘基具有較強的立體特異性，但是倒數第4個氨基酸殘基不具有立體特異性。

發酵乳的工藝參數對ACE抑制肽的生成具有顯著影響。研究單一菌株發酵特性證實，凝乳后ACE抑制活性快速增強，肽含量與ACE抑制活性呈正相關；乳清蛋白含量與發酵乳ACE抑制活性呈負相關，酪蛋白含量與發酵乳ACE抑制活性呈正相關；與常規發酵乳42 ℃發酵溫度相比，37 ℃發酵條件下發酵乳ACE抑制肽含量顯著增加[22]。貯藏期間，發酵乳中抗高血壓活性肽含量也在緩慢增加，原因是4 ℃條件下乳酸菌及其蛋白酶仍在緩慢發生蛋白降解反應[23]。

表 1 乳酸菌源細菌素的分類[27]Table 1 Classification of bacteriocins produced by lactic acid bacteria[27]

4 抗菌肽

抗菌肽具有廣譜抗細菌活性，能殺死革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌和沙門氏菌等。按照來源劃分，抗菌肽包括動物源抗菌肽、植物源抗菌肽和細菌抗菌肽（又稱細菌素）。盡管有大量研究報道了細菌素及其特征與作用模式，但商業化的細菌素很少，乳酸乳球菌來源的Nisin是使用最廣泛的細菌素，在食品中控制革蘭氏陽性菌生長；乳酸片球菌來源的片球菌素PA-1用于抑制肉制品中單增李斯特菌的增殖；麥芽芳香諾桿菌來源的Carnocyclin A在即食肉制品中能防止單增李斯特菌污染。

細菌素的產生機理與常規生物活性肽不同。細菌素在乳酸菌生長過程中被分泌至胞外，由核糖體產生，而大部分生物活性肽可以通過膜內蛋白酶作用由底物蛋白產生，是胞外水解產物[24]。細菌素種類繁多，革蘭氏陽性菌或革蘭氏陰性菌都可以產生細菌素，這些細菌素能夠抑制與產生菌株相關或無關的微生物，可以是小分子質量（＜10 kDa）或大分子質量（＞30 kDa），包含不耐熱肽和耐熱肽，小部分還會經歷轉錄后修飾[25]。因此細菌素的分類方案很難統一。2016年，Alvarez-Sieiro等[26]提出了一種新的分類方法，該方法只包括由乳酸菌和雙歧桿菌產生的細菌素。Venegas-Ortega等[27]在其基礎上進行修正，乳酸菌源細菌素共分為三大類，如表1所示。

de Lima等[28]從開菲爾發酵綿羊乳中鑒定出13 條抗菌肽，貯藏28 d后，活性肽仍表現出抗氧化活性。細菌素與操縱子的合成調節相關。如乳酸乳球菌合成的Nisin與Nisin控制表達（nisin controlled expression，NICE）系統相關，該系統由2 個組成型啟動子和2 個誘導型啟動子組成，Nisin作為誘導劑控制該表達系統[29]。華鶴良[30]篩選得到嗜熱鏈球菌ST和保加利亞乳桿菌IV-3，二者產生的抗菌肽具有廣譜抑菌效果，對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均具有抑菌效果；發酵22～24 h后產生的抗菌肽活性最強，且保加利亞乳桿菌IV-3產生的抗菌肽抑菌效果強于嗜熱鏈球菌ST產生的抗菌肽，這些小分子抗菌肽具有較好的熱穩定性，100 ℃處理20 min仍具有抑菌活性，酸性條件下穩定，易被蛋白酶水解。利用瑞士乳桿菌TUST-005制備的發酵乳不與發酵劑產生拮抗作用，對大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌有抑制效果，該抗菌效果不受胃蛋白酶和胰蛋白酶影響，但高pH值條件下抗菌效果減弱，原因可能是抗菌肽通過其兩親性的α-螺旋插入導質膜中，在膜上形成陽離子通道，改變細胞透性，引起細胞質溢流，從而殺死病原體[31]。Muhialdin等[32]對發酵駱駝乳的抗菌活性進行研究，編號14的組分顯示出最高的抗微生物活性，對糞腸球菌、痢疾志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有抑制作用，該組分含有32 個肽，其中6 種多肽屬于Lactophorin，分子質量0.992～1.713 kDa。

由于傳統抗生素的不規范使用，自然界中的微生物通過改變細胞膜動力學結構或增強蛋白水解酶活性，對抗生素產生抗性，還會發生耐藥基因轉移現象。因此，未來需要嚴格制定不同抗菌肽的使用量與使用規則，以避免該種情況的發生。

5 其他功能活性肽

5.1 降血糖肽

乳制品對胰島素分泌和血糖控制的益處歸因于刺激胰島素分泌的大量必需氨基酸和生物活性肽、大量營養素和微量營養素的特定組合，以及干酪和發酵乳中發現的獨特益生菌菌株和生物活性肽；目前發現多肽VAGTWY和LPQNIPP可以用于幫助控制糖尿病患者的血糖水平和胰島素分泌[33]。

5.2 阿片樣肽

阿片類化合物是能夠結合阿片類受體并發揮激動劑或拮抗劑作用的化合物。阿片肽的序列中包括芳香族氨基酸，如其N端序列中的酪氨酸和脯氨酸。酪氨酸被證明是絕對必要的，因為這種替代會導致阿片肽活性的喪失[34]。

5.3 免疫調節肽

乳源性肽的免疫調節活性通常表現在兩方面：一是刺激淋巴活力并促進增殖，其中肽主要來源于β-酪蛋白和κ-酪蛋白；另一種是抑制淋巴細胞活性和減少增殖，其中大多數來源于α-酪蛋白的肽起到這種作用。免疫系統的正調節因子可以促進免疫細胞分泌多種免疫因子，如免疫球蛋白A、白細胞介素-6（interleukin 6，IL-6）等，以增強人體免疫力。當負調節因子抑制淋巴細胞增殖時，會上調IL-10的表達，下調IL-2的表達，從而降低人體過敏反應[35]。Qian Bingjun等[36]對德氏乳桿菌LB340發酵的發酵乳離心后進行超濾，得到4 個肽級組分，分子質量分別為5～10、3～5、1～3 kDa和＜1 kDa；分子質量3～5 kDa的肽顯示出良好的抗氧化活性，將分子質量＜1 kDa的肽用Superdex-30 G柱分離，產生6 個組分，其中組分F2表現出最高的ACE抑制活性，IC50為67.71 mg/mL，組分F6對小鼠脾淋巴細胞增殖有積極作用，刺激指數為0.729，具有良好免疫調節活性。

5.4 多功能肽

具有單一生物活性（如抗氧化、抗高血壓和抗菌）的發酵乳活性肽被大量研究報道，但很少有研究描述多功能生物活性肽。多功能活性肽因同時觸發、調節或抑制多種生理途徑，其活性可能優于單活性肽。Aguilar-Toala等[37]評估特定植物乳桿菌制備的發酵乳的抗炎、抗溶血、抗氧化、抗突變和抗菌活性，結果表明，總的來說，發酵乳粗提取物活性最高，其次為分子質量小于3 kDa的肽組分，最后為分子質量3～10 kDa的肽組分；其中，植物乳桿菌55顯示出較高的抗炎活性（723.68～1 759.43 mg/mL雙氯芬酸鈉當量）、抗溶血活性（抑制率36.65%～74.45%）和抗氧化活性（282.8～362.3 μmol/mL Trolox）。

6 生物活性肽的序列鑒定與功能預測

生物活性肽鑒定的常規方法是以某種生物活性為目的，利用多種純化分離方法得到活性強的部分并鑒定，但該流程可能會導致含量低的活性肽未被檢測出。徐海紅等[38]通過前處理富集發酵乳中的多肽，建立計算機聯合超高效液相色譜的分子質量匹配序列技術，共鑒定出118 條多肽。

鑒定發酵乳中乳酸菌產生的生物活性肽功能潛力可以通過2 種方式預測。第1種是分析乳酸菌蛋白水解系統的基因組，確定不同的酶活性或底物特異性；第2種是使用計算機方法定量多肽結構與活性的關系，評估產生生物活性肽的蛋白質基質組成特性。隨著生物活性肽數據庫的建立和文獻積累，將生物信息學與實驗結果相結合為肽的潛在功能預測提供了極好的基礎，并可用于大型實驗室菌株收集與篩選。其中，定量構效關系和分子對接常用于預測新型活性肽的結構與活性。Deng Baichuan等[39]從數據庫中篩選收集了141 種ACE抑制肽，使用定量構效關系預測了5 種新型ACE抑制肽的IC50，并通過體外實驗進行驗證，發現影響ACE抑制活性最相關的特性為疏水性、空間效應與電子特性，C端氨基酸作用大于N端氨基酸。Tu Maolin等[40]利用分子對接法篩選出酪蛋白酶解產物中一種新的多肽EKVNELSK，該肽來自αs1-酪蛋白（f35-42），與ACE的親和力最強，人工合成該肽，發現其ACE抑制活性IC50為5.998 mmol/L。

7 結 論

發酵乳中生物活性肽主要來源于乳酸菌的蛋白水解，蛋白酶的差異化導致了生物活性肽的多樣性。目前乳蛋白中新的生物活性肽及其在發酵乳制品中的生理功能仍在不斷擴增，包括預防和控制某些疾病，如高血壓、Ⅱ型糖尿病或肥胖癥以及更廣泛的代謝綜合征，這為開發新型功能性乳制品提供了良好的技術支撐。隨著組學技術的飛速發展，轉錄組學和蛋白質組學正逐步應用于解釋這一復雜過程。乳酸菌發酵獲取生物活性肽被認為是一種經濟并能規模化的技術，包括抗氧化肽、降血壓肽和抗菌肽等。未來需要進一步研究活性肽的確切作用機制，闡明肽活性與肽的構效關系，使用動物模型或臨床實驗來驗證其在體內的生物活性。