嬰幼兒配方乳粉中甲醛含量測定及暴露污染評估

陳同強，荊輝華，彭國泰，易守福，徐文泱，王亮亮，李凱龍，李 燦，向 禮,*

（1.食品安全監測與預警湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410111；2.湖南省食品質量監督檢驗研究院，湖南 長沙 410000；3.湖南省植物保護研究所，湖南 長沙 410125）

甲醛是一種無色有刺激性氣體，同時也是一種常見的食品有機污染物。甲醛的主要危害為對皮膚黏膜的刺激作用，嚴重時可引起呼吸困難、肺水腫等癥狀[1-2]，長期接觸甚至可能引發白血病等疾病[3]。近年來，大量調查研究顯示諸多食品中檢出甲醛，如水產品、香菇等農產品，然而大部分食品中的甲醛并非人為添加或因環境污染導致，而是在其生長、貯藏和加工過程自然產生[4-5]。嬰幼兒配方乳粉作為一類特殊食品，在日常檢驗工作中發現其中甲醛的檢出率處于較高水平，有研究稱可能是嬰幼兒配方乳粉在高溫條件下，加上其中某些營養強化劑的促進而生成甲醛[6-7]。乳粉中甲醛的殘留可能會給嬰幼兒健康帶來風險，目前因缺乏足夠的實驗數據及膳食數據的支持，我國尚未對嬰幼兒配方乳粉中甲醛作限量要求。

食品中甲醛存在形式除了游離態，還有結合態，如蛋白質易與甲醛結合形成甲醛-蛋白質復合物，葡萄酒中甲醛常以與SO2結合的形式存在等。結合態的甲醛又分為可逆與不可逆2 種結合方式。

目前國內外對于甲醛的檢測方法較多，大多采用光譜法[8-10]、氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法[11-13]、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[14-17]等這些方法檢出限往往較高且容易受到干擾，HPLC法與GC-MS法雖相對準確，但對前處理要求很高，回收率較低，因此，難以適應基質本身較為復雜的嬰幼兒配方乳粉中微量甲醛的測定。本研究優化一種GC法對嬰幼兒配方乳粉中甲醛進行定性及定量測定，同時采用GC-MS確證。在不同水溫下沖調乳粉，分別對其中的甲醛含量進行檢測，比較不同水溫沖調對乳粉中甲醛含量的影響，同時對網購45 份嬰幼兒配方乳粉的甲醛污染水平進行調查分析與風險暴露評估，為生產企業保障產品質量安全和政府部門制定嬰幼兒配方乳粉中甲醛的限量提供一定的數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嬰幼兒配方乳粉45 份（網購，國產品牌20 份，國外品牌25 份），0～6 月齡、6～12 月齡、12～36 月齡各15 份。

甲醛標準溶液（100 mg/L） 國家標準物質中心；2,4-二硝基苯肼（分析純）、乙腈（色譜純）、環己烷（色譜純） 阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設備

7890A氣相色譜儀（配備電子捕獲檢測器（electron capture detector，ECD））、HP-5毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、7890B-5977B氣相色譜-質譜儀、DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 標準反應液制備

衍生液的配制：稱取適量2,4-二硝基苯肼，用乙腈配制成質量濃度為0.5 g/L的溶液，再與磷酸鹽緩沖溶液（pH 5）按體積比1∶1混合即得。

分別移取0.00、0.01、0.02、0.05、0.08、0.10 mL甲醛標準溶液，置于50 mL塑料離心管中，分別加入10.0 mL衍生液，搖勻，于60 ℃水浴中反應1 h，取出冷卻后，加入4～5 g硫酸銨固體，混勻，靜置5 min，向標準反應液中加入5.0 mL環己烷，渦旋1 min后，5 000 r/min離心5 min，分層，得到不同甲醛質量濃度的標準衍生溶液，取上清液，加入5 g無水硫酸鈉處理，供GC分析。

1.3.2 樣品反應液制備

稱取乳粉樣品2.0 g左右于50 mL塑料離心管中，加入10.0 mL衍生液，渦旋混勻，60 ℃水浴振搖1 h，取出后冷卻至室溫，加入4～5 g硫酸銨固體，混勻，靜置5 min，加入5.0 mL環己烷，渦旋1 min后，5 000 r/min離心5 min，分層，取上清液，加入5 g無水硫酸鈉處理，供GC及GC-MS分析。

1.3.3 GC條件

進樣口溫度250 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量1 mL，不分流進樣；升溫程序：初始溫度40 ℃，以20 ℃/min的速率升溫至240 ℃并保持2 min；ECD檢測器溫度300 ℃。

1.3.4 GC-MS條件

進樣口溫度250 ℃，流速1.0 mL/min，進樣量1 mL，不分流進樣；升溫程序：初始溫度60 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升溫至180 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升溫至280 ℃，保持5 min；離子源溫度230 ℃；電離方式：電子轟擊；確證方式：全掃描與選擇離子監測模式。

1.3.5 不同沖調溫度對乳粉中甲醛含量的影響

隨機選取其中1 份乳粉樣品，按照標簽說明，稱取樣品30.0 g（約7 平勺），共6 份，每份分別采用30、40、50、60、70、80 ℃的水200 mL進行沖調，密封，待冷卻后，稱取10.0 g，甲醛含量檢測過程同1.3.2節。

1.3.6 甲醛的暴露量計算

甲醛含量按式（1）計算。

式中：C為乳粉中甲醛含量/（mg/kg）；m1為從標準工作曲線得到的樣液中甲醛質量/μg；m為乳粉質量/g。

甲醛暴露量按式（2）計算。

式中：I為甲醛暴露量/（μg/kg）；C為乳粉中甲醛含量/（mg/kg）；m2為乳粉日攝入量/g；m3為嬰幼兒體質量/kg。

不同月齡嬰幼兒體質量和嬰幼兒配方乳粉日攝入量參考值如表1所示。

表 1 不同月齡嬰幼兒體質量和嬰幼兒配方乳粉日攝入量Table 1 Body mass and daily intake of infant formula in infants of different ages

1.4 數據處理

數據處理及繪圖采用Excel 2010軟件完成。

2 結果與分析

2.1 樣品提取方法選擇

乳粉中甲醛主要為游離態甲醛和以蛋白質-甲醛復合物形式存在的結合態甲醛，內源性甲醛主要生成途徑有糖和氨基酸的美拉德反應[9]。將乳粉樣品分別經常見的水浸法、水蒸氣蒸餾法和衍生液提取法3 種方法提取。

表 2 不同提取方法對嬰幼兒配方乳粉中甲醛含量測定結果的影響Table 2 Effect of different extraction methods on formaldehyde determination in infant formula

由表2可知，水浸法僅能提取到乳粉中游離甲醛，甲醛含量測定結果遠低于其他2 種提取方法，因此不適合乳粉樣品的前處理。水蒸氣蒸餾法和衍生液提取法測得甲醛含量相近，且均遠高于水浸法提取甲醛含量，表明該2 種方法均能提取乳粉中游離甲醛和可逆結合態甲醛。水蒸氣蒸餾法的檢測結果略高于衍生液提取法，原因可能為蒸餾過程導致乳粉顏色變深，發生美拉德反應，生成了內源性甲醛[9]。日常檢驗數據顯示乳粉樣品中甲醛含量一般相對較低，且乳粉屬于復雜基質樣品，如果提取方法不當，會使提取液中的甲醛含量過低，導致不能檢出或干擾較大，影響檢測結果。同時稱取空白乳粉2.0 g，加入甲醛標準溶液，使得甲醛最終加標量為3.0 mg/kg，分別經水浸法、水蒸氣蒸餾法和衍生液提取法處理，計算得到加標回收率分別為63.4%、110.4%、96.9%。因此，綜合考慮選擇衍生液提取法提取乳粉樣品中微量甲醛更為合適。

2.2 衍生液與沉淀劑的選擇

比較2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 7水溶液（體積比1∶1）、2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 5磷酸鹽緩沖液（體積比1∶1）和2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 2磷酸鹽緩沖液（體積比1∶1）3 種衍生體系提取乳粉樣品中甲醛的效果。

圖 1 不同衍生體系對乳粉中甲醛的提取效果（n=3）Fig. 1 Extraction efficiency of formaldehyde from milk powder with different derivatization systems (n = 3)

由圖1可知：pH 7體系的甲醛含量測定值較低，可見此條件不利于提取樣品中的可逆結合態甲醛；pH 2體系的甲醛測定值較高，但樣品中成分復雜，可能衍生形成其他醛類物質，其甲醛衍生物與甲醛標準品衍生物的GC譜圖不能完全重疊，表明目標峰中存在雜質峰干擾；pH 5體系與pH 2體系的甲醛測定值接近，乳粉中蛋白質-甲醛復合物在弱酸性條件下受熱分解釋放出甲醛，衍生劑與甲醛反應形成穩定的甲醛衍生化物，有利于提取樣品中可逆結合態甲醛，因此，選擇2,4-二硝基苯肼乙腈溶液-pH 5磷酸鹽緩沖液（體積比1∶1）作為衍生液。

由于乳粉樣品中蛋白質含量較高，對甲醛的提取效果影響較大，需對其進行凈化處理。選擇三氯乙酸、乙酸鉛和硫酸銨3 種常見的沉淀劑，比較三者沉淀效果。結果發現：采用三氯乙酸與乙酸鉛作為沉淀劑，試劑空白值較高，干擾檢測結果；而硫酸銨則能較好沉淀蛋白質和水溶性雜質，因此選擇硫酸銨作為沉淀劑。

2.3 衍生溫度的選擇

圖 2 衍生溫度對甲醛衍生物峰面積的影響（n=3）Fig. 2 Influence of derivatization temperature on peak area of formaldehyde derivative (n = 3)

由圖2可知，衍生溫度40～90 ℃，隨著衍生溫度上升，甲醛衍生物的峰面積逐漸增加，當溫度達到60 ℃時，繼續升高溫度，峰面積已趨于穩定，即衍生效率達到最大，因此選擇60 ℃作為甲醛的衍生溫度。

2.4 衍生時間的選擇

圖 3 衍生時間對甲醛衍生物峰面積的影響（n=3）Fig. 3 Effect of derivatization time on peak area of formaldehyde derivative (n = 3)

由圖3可知，采用甲醛衍生物的峰面積表示衍生效率，隨衍生時間的延長峰面積隨之增加，60 min后趨于穩定。因此，衍生時間設定為60 min。

2.6 標準譜圖與線性范圍

圖 4 甲醛標準溶液衍生物GC圖譜Fig. 4 GC chromatogram of derivatized formaldehyde standard solution

由圖4可知，甲醛標準溶液衍生物GC色譜峰形良好，無雜質峰干擾。以標準溶液中甲醛質量為橫坐標（μg），響應峰面積為縱坐標繪制標準曲線，在0～10 μg范圍內，線性關系良好，r均大于0.999。

圖 5 甲醛標準溶液衍生物總離子流圖（A）及對應質譜圖（B）Fig. 5 Total ion current chromatogram (A) and mass spectrum (B) of derivatized formaldehyde standard solution

由圖5可知，對于目標峰采用GC-MS進行確證，采用全掃描模式，扣除背景干擾后，將對應質譜圖與NIST譜庫進行匹配，找到甲醛衍生物（甲醛-2,4-二硝基苯腙）出峰位置，匹配度高達95.4%。

考慮離子豐度及受干擾程度，選擇監測離子m/z為79、122、179、210，如圖6所示。

圖 6 甲醛標準溶液衍生物選擇性離子監測譜圖（A）及對應質譜圖（B）Fig. 6 Selected ion monitoring chromatogram (A) and mass spectrum (B)of derivatized formaldehyde standard solution

對陽性乳粉樣品中甲醛進行確證，背景扣除后，陽性乳粉樣品選擇性離子監測譜圖及對應質譜圖如圖7所示。

圖 7 陽性乳粉樣品選擇性離子監測譜圖（A）及對應質譜圖（B）Fig. 7 Selected ion monitoring chromatogram (A) and mass spectrum (B)of positive milk powder sample

2.7 檢出限與定量限

選擇適宜質量濃度的甲醛標準溶液進樣，觀察其噪音強度，將3 倍信噪比（RS/N）作為檢出限，稀釋甲醛標準溶液，使其在儀器上響應強度為3 倍信噪比，計算得甲醛檢出限為0.1 mg/kg；稀釋甲醛標準溶液，使其在儀器上響應強度為10 倍信噪比，以10 倍信噪比（RS/N）作為定量限，計算得甲醛定量限為0.3 mg/kg。結果表明，所建立的方法靈敏度較高。

2.8 加標回收實驗與精密度實驗

圖 8 陰性乳粉樣品GC圖譜Fig. 8 GC chromatogram of negative milk powder sample

圖 9 加標（0.3 mg/kg）乳粉樣品GC圖譜Fig. 9 GC chromatogram of spiked milk powder sample (0.3 mg/kg)

分別稱取空白（陰性，不含甲醛）乳粉樣品（實驗室留樣）約2.0 g共18 份，分別加入適量甲醛標準溶液，添加量分別達到定量限、2 倍定量限、10 倍定量限3 個添加水平，采用陰性樣品進行系統空白背景考察，如圖8～9所示，甲醛出峰位置基本無干擾。

表 3 甲醛在不同加標量下的加標回收率（n=6）Table 3 Recoveries of formaldehyde at different spiked concentrations (n= 6)

由表3 可知，不同加標水平下平均回收率為88.3%～96.7%，相對標準偏差小于10%。

2.9 不同沖調溫度下乳粉中甲醛含量比較

圖 10 不同沖調溫度下甲醛含量變化Fig. 10 Change in formaldehyde content under different reconstitution temperatures

由圖10可知，將相同質量乳粉分別直接按1.3.2節處理，與經40 ℃溫水沖調后再按1.3.2節處理測得乳粉中甲醛含量基本一致。然而，當沖調溫度大于40 ℃，隨著溫度繼續升高，沖調后的乳粉樣品中甲醛含量呈現上升趨勢，分析可能原因為隨著溫度升高，促使美拉德反應發生，產生了新的甲醛。

2.10 網購乳粉樣品的甲醛含量檢測結果

為模擬實際攝入過程，使甲醛污染暴露評估更科學合理，對網購的45 份嬰幼兒配方乳粉采用40 ℃溫水進行沖調，溶解混合均勻后對其中甲醛含量進行測定。

表 4 45 份嬰幼兒配方乳粉（經40 ℃溫水沖調）中甲醛含量測定結果（n=3）Table 4 Results of determination of formaldehyde in 45 infant formula samples reconstituted with warm water at 40 ℃ (n= 3)

由表4可知，甲醛檢出率為100%，雖然45 份嬰幼兒配方乳粉樣品總體甲醛含量（0.38～2.72 mg/kg）不高，但仍然可能會對以嬰幼兒配方乳粉為主食的嬰幼兒健康帶來一定風險。

目前國內外針對甲醛的安全攝入量暫無明確要求，美國環境保護局建議甲醛每日允許攝入量（allowable daily intake，ADI）為0.2 mg/kg，ADI越大，說明該物質對人體健康的危害越小[19]。本研究中甲醛暴露風險暫按0.2 mg/kg來評估。由表4可知，12～36 月齡嬰幼兒的甲醛平均暴露水平最高，這可能與其中某些營養強化劑含量有一定相關性，如硫酸亞鐵、VC等，可促進嬰幼兒配方乳粉中內源性甲醛的形成[7]。

3 結 論

采用GC法結合GC-MS對嬰幼兒配方乳粉中甲醛含量進行測定與確證，通過優化前處理條件，對方法的線性范圍、精密度、準確度、檢出限及定量限等技術參數進行了評價。采用此法檢測不同沖調溫度下乳粉樣品中甲醛含量的變化及網購45 份嬰幼兒配方乳粉經沖調后的甲醛含量，結果顯示，該檢測方法靈敏、準確且重復性好。當沖調溫度高于40 ℃，隨著沖調溫度的升高，甲醛含量逐漸增加，可能原因為高溫促進了美拉德反應生成內源性甲醛，因此，沖調乳粉時水溫不宜過高，一般按照產品推薦溫度（40 ℃左右）較合適。對嬰幼兒配方乳粉中甲醛平均暴露量進行統計，雖與ADI存在一定差距，但對于將配方乳粉作為主要營養攝入且體質較敏感的嬰幼兒來說，尤其是12～36 月齡的嬰兒，甲醛攝入帶來的健康風險仍需引起足夠的重視。關于影響乳粉中內源性甲醛形成的具體因素還有待于進一步挖掘與研究。