成熟過程對紅曲霉干酪中生物胺的影響及其安全性評估

劉 景，劉振民*

（乳業生物技術國家重點實驗室，上海乳業生物工程技術研究中心，光明乳業股份有限公司乳業研究院，上海 200436）

生物胺是一類具有一定生物活性的低分子質量含氮化合物的總稱，但人體攝入過量時則會產生頭痛、惡心、血壓波動、呼吸困難等多種過敏性反應。天然干酪中的生物胺主要由蛋白質水解生成的游離氨基酸為底物、經特定的酶脫羧產生[1]。生物胺普遍存在于多種食品中，如水產品、發酵酒、乳制品、肉類、蔬果等。乳制品中以干酪中生物胺最為典型。干酪中常見生物胺有組胺、酪胺、腐胺、尸胺、色胺、β-苯乙胺、精胺、亞精胺8 種[2]。就組胺來說，干酪中的含量僅次于以魚類為代表的水產品[3]。因此，食品中天然產生的生物胺是食品安全關注重點之一。

目前，國際上對食品中的生物胺尚無統一限量標準，各國分別依據本國的法律法規制定標準。例如，美國食品藥品監督管理局將金槍魚等魚類中組胺的安全閾值設定為50 mg/kg，而酪胺和苯乙胺的安全閾值則分別為100～800 mg/kg和30 mg/kg[4]。印度規定生鮮和即食魚產品中組胺可接受限量為100 mg/kg，最大殘留量為200 mg/kg；而干制和發酵魚制品中上述限量值分別為200 mg/kg和400 mg/kg[5]。我國則在地方標準中規定發酵肉制品中組胺含量不高于100 mg/kg[6]。

霉菌成熟干酪是一類以霉菌作為發酵劑生產的干酪，目前使用較多的霉菌發酵劑主要為卡地干酪青霉（Penicillium camemberti）、婁地青霉（Penicillium roqueforti）和白地霉（Geotrichum candidum），常見的霉菌干酪主要有藍紋干酪、卡門貝爾干酪和布里干酪等[7]。紅曲霉是中國傳統食物紅腐乳、紅曲米、紅曲酒等的主要霉菌發酵原料。紅曲霉作為干酪霉菌發酵劑不僅風味、色澤易于被大多數國人接受，是霉菌干酪進入大眾消費領域的良好媒介，而且紅曲霉發酵產物被證實含有多種有益人體的活性物質，如洛伐他汀、γ-氨基丁酸、麥角固醇等，具有良好的營養附加值。因此，近年來許多研究嘗試使用紅曲霉制作霉菌干酪[8-9]。但這些研究集中于將紅曲霉應用于干酪的工藝和制作方法以及紅曲霉對干酪質構和風味產生的影響，對食品安全，尤其是紅曲霉干酪中生物胺的影響研究還很少。

本研究以生乳為主要原料，在霉菌干酪加工工藝的基礎上，使用紅曲霉作為霉菌發酵劑，制作紅曲霉干酪，研究紅曲霉干酪成熟過程中，不同的成熟條件對產生的生物胺種類及含量的影響，并在此基礎上開展對紅曲霉干酪中生物胺攝入的初步安全評估。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生乳取自光明金山牧場。

乳酸菌發酵劑YO-MIX 900 科漢森（中國）有限公司；凝乳酶Marzyme 150MG 丹尼斯克（中國）有限公司；紅曲霉菌種（編號GM1809，來源于腐乳）為自行保藏菌株；組胺、色胺、β-苯乙胺、酪胺、尸胺、腐胺、亞精胺、精胺標準品（均為色譜純） 美國Sigma公司；丹磺酰氯、碳酸鈉、碳酸氫鈉、甲醇、丙酮、正庚烷（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

精密天平 德國Santorius公司；1260高效液相色譜儀、Zorbax Eclipse XDB-C18高效液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國Agilent公司；干酪槽、模具等為自制。

1.3 方法

1.3.1 紅曲霉干酪加工工藝

生牛乳→標準化（蛋白質含量3.1 g/100 mL）→巴氏殺菌（72 ℃、20 s）→冷卻（37 ℃）→接種乳酸菌發酵劑（1 g/100 L）→添加霉菌發酵液（體積比3%）→發酵（34 ℃、1.5 h）→加凝乳酶（40 IMCU/L）→切割→攪拌→入模排乳清→18 h后脫模→鹽浸（17 g/100 mL NaCl溶液，2 h）→成熟（10～20 ℃、25 d，相對濕度95%）→包裝→4 ℃存放

其中，成熟過程需要注意環境清潔，前72 h內每隔24 h翻轉通風，后期2～3 d翻轉1 次。在10、14、20 ℃ 3 個不同溫度成熟條件下分別檢測紅曲霉干酪中的生物胺含量，測定時間節點為0、3、7、14、21、25 d。

1.3.2 紅曲霉干酪中生物胺的測定

預處理及衍生化：取5 g紅曲霉干酪樣品（稱質量前整塊攪碎并混合均勻），加入15 mL 0.6 mol/L高氯酸溶液混勻，振蕩30 min后2 000×g離心10min，取上清液；按以上步驟使用高氯酸提取樣品3 次，合并上清液并過濾至容量瓶；用0.6 mol/L高氯酸溶液將濾液定容至50 mL，搖勻取0.5 mL樣液，加入1.5 mL碳酸鹽緩沖液（NaH2PO4·2H2O-Na2HPO4·2H2O，pH 10.0）和2 mL 7.5 g/L丹磺酰氯溶液（溶劑為丙酮），60 ℃反應45 min后，40 ℃氮吹除去丙酮溶劑，加入3 mL正庚烷萃取，吸取上清液，氮氣吹干后加入1 mL甲醇完全溶解，經0.45 μm濾膜過濾后待測。

高效液相色譜測定：參照劉景等[10]的方法，使用高效液相C18反相色譜分離衍生化樣品，衍生化試劑為丹磺酰氯，計算生物胺含量。

1.3.3 紅曲霉干酪中生物胺的安全評估

本研究采用非參數概率評估模型（式（1））評估紅曲霉干酪中生物胺的風險[11]。

式中：y為紅曲霉干酪中生物胺暴露量/（μg/（kg·d））；p為生物胺的種類數；x為膳食調查中干酪的消費量/（g/d）；c為紅曲霉干酪中生物胺的檢測值/（mg/kg）；m為人群體質量/kg。其中，膳食調查干酪消費量數據來自乳制品消費調查資料[12-14]，人群體質量數據來自中國居民營養與健康調查系列報告[15-16]。

分別將x和c作為2 個獨立分布的總體，獲得特定的分布特征和參數，在這2 個總體中進行隨機抽樣并配對相乘，并使用m進行校正，從而獲得y的概率分布。該模型的變異程度使用暴露量分布的特征統計量（如平均值等）和百分位點值表示。

健康指導值的設定能為風險管理者提供風險評估的定量信息，從而做出保護人類健康的決策。根據健康的劑量-反應關系，攝入50 mg生物胺并不會引起毒性反應。當攝入75 mg及以上生物胺時，可能導致充血、腹瀉、頭痛等癥狀[17-19]。因此，本研究以安全閾值較低的50 mg作為無毒性參考劑量（reference no toxicological dose，RFNTD）。使用健康指導值安全日攝入量（safe daily intake，SDI），根據定量風險評估結果給出建議攝入范圍。

中國人群建議的紅曲霉干酪SDI按式（2）計算。

式中：c為紅曲霉干酪中生物胺含量/（mg/kg）。

1.4 數據處理

使用@Risk 7.0軟件（Palisade公司）的Monte-Carlo模擬，在式（1）中2 個獨立分布總體中進行隨機抽樣，并配對運算，得到概率分布。

2 結果與分析

2.1 成熟時間對紅曲霉干酪中生物胺含量的影響

圖 1 成熟時間對紅曲霉干酪生物胺含量的影響Fig. 1 Influence of ripening time on biogenic amines contents in Monascus-fermented cheese

由圖1可知，隨著成熟時間的延長，紅曲霉干酪中生物胺含量的變化存在以下特點：紅曲霉干酪中的生物胺為β-苯乙胺和酪胺，其他生物胺均未檢出，其中酪胺在成熟前期（＞3 d）出現，β-苯乙胺在成熟后期（＞14 d）出現，酪胺和β-苯乙胺可能是紅曲霉干酪中的典型生物胺；總生物胺含量隨著成熟時間延長而不斷增加，成熟14 d后，由于β-苯乙胺的出現增加更為快速，14 d的成熟時間可能是紅曲霉干酪生物胺控制的關鍵節點。由于苯乙胺的毒性閾值較酪胺更低[17]，因此，生產中應盡量避免β-苯乙胺的生成，在風味、質地等滿足質量要求的前提下，紅曲霉干酪成熟時間應盡量縮短。

2.2 成熟溫度對紅曲霉干酪中生物胺含量的影響

表 1 不同成熟條件下紅曲霉干酪中生物胺含量Table 1 Concentrations of biogenic amines in Monascus-fermented cheese under different ripening conditions

由表1可知：成熟溫度較低（10～14 ℃）時，紅曲霉干酪中的生物胺為β-苯乙胺和酪胺，且這2 種生物胺含量均隨成熟時間的延長而增加，其中酪胺含量高于β-苯乙胺；成熟溫度較高（20 ℃）時，除了β-苯乙胺和酪胺之外，組胺也開始生成，但含量低于前兩者。值得注意的是，當成熟溫度上升時，3 種生物胺的增長均較為快速，出現的時間點也提前。其中，酪胺生成較β-苯乙胺和組胺更多、含量增加更為迅速，出現也相對最早（成熟溫度10 ℃，成熟時間＞7 d）。

由于成熟時間會影響干酪風味物質的形成[18,20]，因此在風味、質地區別不大的前提下，紅曲霉干酪的成熟時間為14～21 d，有利于避免產生較高含量的生物胺。本研究在全面考察風味、質地、生物胺等因素后，將紅曲霉干酪的成熟條件定為14 ℃、12～14 d。

2.3 紅曲霉干酪中生物胺的安全攝入評估

按以上成熟條件制作9 批紅曲霉干酪，并檢測其中的生物胺含量。使用1.3.3節方法評估紅曲霉干酪中生物胺在中國人群中的安全性。

由表2可知，當紅曲霉干酪中生物胺的暴露量為49.42 μg/（kg·d）時，97.5%人群具有暴露風險；而暴露量升高到94.72μg/（kg·d）時，則99%的人群處于暴露風險中。

表 2 中國人群對紅曲霉干酪中生物胺的暴露評估結果Table 2 Exposure assessment to biogenic amines in Monascusfermented cheese in Chinese population

表 3 中國人群對紅曲霉干酪的SDITable 3 SDI of Monascus-fermented cheese in Chinese population

對中國地區人群來說，針對經由膳食暴露的紅曲霉干酪中生物胺而引發的食品安全風險。由表3可知，為保證99.9%人群的紅曲霉干酪生物胺暴露安全，建議人均紅曲霉干酪攝入量不超過58 g/d。

3 結 論

紅曲霉干酪是一種以中國傳統食品原料紅曲作為霉菌發酵劑制成的新型干酪。本研究對紅曲霉干酪中生物胺的種類、數量、在成熟過程中的變化及其安全性評估作了較為系統的研究。

紅曲霉干酪中生物胺含量隨成熟時間的延長、溫度的增加呈增加趨勢，酪胺、β-苯乙胺和組胺是其中檢出的3 種典型生物胺。β-苯乙胺多出現在成熟后期（＞7 d），組胺出現在成熟溫度較高（＞14 ℃）的條件下，相比之下，酪胺的含量和增長速率均高于其他2 種生物胺，出現時間也最早。在紅曲霉干酪實際生產中，為減少生物胺的生成同時保證良好風味和質構特性，成熟條件應在溫度和時間2 個重要影響因素中選擇適當的平衡點。本研究表明，成熟溫度14 ℃、成熟時間12～14 d是紅曲霉干酪較為適宜的成熟條件。

以紅曲霉干酪生物胺含量檢測數據、膳食調查和人群體質量為基礎的紅曲霉干酪生物胺暴露評估結果表明，中國人群紅曲霉干酪生物胺暴露平均值為8.55 μg/（kg·d），P99百分位值為94.72 μg/（kg·d），以該暴露評估結果為基礎得到中國人群紅曲霉干酪的健康指導值。為保證99.9%人群的紅曲霉干酪生物胺暴露安全，建議人均紅曲霉干酪攝入量不超過58 g/d。